Profesor William Albert Catterall to światowej klasy ekspert w zakresie budowy i funkcjonowania kanałów jonowych. Co mnie niepomiernie cieszy to to, że ostatnimi czasy jego dociekania dotyczą także autyzmu. Dzisiejszy, krótki post będzie dotyczył głównie jego publikacji "Autistic behavior in Scn1a+/− mice and rescue by enhanced GABAergic transmission[1]". Jak mogliśmy się przekonać z poprzednich postów dotyczących kanałów sodowych różne defekty różnych kanałów sodowych rodzą różne konsekwencje. Nic nie jest tu proste i oczywiste. Wydaje się, że jednym z kryteriów podziału tych defektów może być ocena w jakim stopniu dany defekt wpływa na pracę kanału, czy konsekwencją defektu jest nadmierna przepuszczalność kanału czy też wprost przeciwnie, ograniczona przepuszczalność. Żadna z tych skrajności nie jest pożądana. Wydaje się, że nadmierna przepuszczalność kanału skutkuje raczej padaczką, podczas gdy ograniczona przepuszczalność powoduje raczej autyzm. Co ciekawe, u niektórych osób z defektem skutkującym brakiem działania kanału sodowego (i widocznym autyzmem) występuje też padaczka. To może sugerować, że podział ze względu na nadmierną/ograniczoną przepuszczalność nie jest do końca precyzyjny. Pewne wskazówki widać z prac badaczy nad Zespołem Draveta. Zespół Draveta spowodowany jest przez mutacje w genie SCN1A, które skutkują tym, że kanały sodowe Nav1.1 przestają przepuszczać jony. Brak funkcjonowania kanałów sodowych pozostaje w sprzeczności z obserwowaną u pacjentów padaczką. Wydaje się, że to nadmierna przepuszczalność kanału (a nie jej brak) powinna skutkować padaczką. Sprawy są trochę bardziej skomplikowane.
One current research project focuses on severe myoclonic epilepsy of infancy, an autosomal dominant genetic epileptic encephalopathy with devastating consequences for affected children, which is caused by heterozygous loss-of-function mutations in the gene encoding the brain sodium channel Nav1.1. He has developed a mouse genetic model that recapitulates all of the features of this disease, including the pattern and severity of seizures and the co-morbidities. With this mouse model, he has shown that the primary pathogenic event in this disease is failure of action potential generation in GABAergic inhibitory neurons. This impairment disinhibits the excitatory neurons and causes uncontrolled hyperexcitability and epilepsy, as well as ataxia, sleep disturbance and other co-morbidities.
Sodium channels are critical regulators of neuronal excitability. De novo loss of function mutations in the SCN1A potentially lead to haploinsufficiency of Nav1.1 channels. Theoretically, haploinsufficiency of the Nav1.1 channel should not cause epilepsy because reduced sodium current produces neuronal inexcitability rather than hyperexcitability that is associated with seizure activity.
Dr. Catterall has generated mouse models of Dravet Syndrome by ablating the SCN1A gene in mice and has shown that dramatic loss of sodium current in the hippocampal GABAergic inhibitory neurons in these mice may cause their epilepsy.
The results of these mouse models suggest that failure of excitability of hippocampal GABAergic inhibitory neurons is a possible cause of this intractable epilepsy syndrome.
Dr. Catterall found that mice with a heterozygous loss of one allele of the Nav1.1 channel gene are ataxic, as measured in tests of walking a straight line and walking on a narrow rod. Analysis of the cerebellar Purkinje neurons, which are crucial in coordinating movement, show that there is a dramatic loss of sodium current. Loss of excitability of these neurons is sufficient to cause profound ataxia.
The Purkinje neurons are unique because they are GABAergic inhibitory neurons that serve as projection neurons, in contrast to virtually all other projection neurons, which are excitatory. Dr. Catterall’s team believes that the dramatic loss of sodium current in both the hippocampal inhibitory GABAergic interneurons and the cerebellar inhibitory Purkinje neurons means that many classes of GABAergic neurons throughout the brain may have reduced sodium currents and reduced excitability, and that impaired excitability of these other inhibitory neurons may be responsible for other aspects of the disease like spasticity and cognitive impairment.
http://www.ice-epilepsy.org/the-sodium-channel-and-morbidities-associated-with-dravet-syndrome.html
Z powyższych cytatów wyłania się następujący obraz. Utrata funkcji przez kanały sodowe powoduje, że trudniej je wzbudzić. To sugeruje, że padaczka nie powinna występować. Ponieważ kanały sodowe (w tym przypadku Nav1.1) występują także w hipokampie to neurony, które tam występują również trudniej wzbudzić. Ale GABAminergiczne neurony, które tam występują mają za zadanie wyhamowywać nadmierną ekscytację innych neuronów. Ich utrudnione wzburzenie skutkuje tym, że nie mogą prawidłowo wykonywać swojej pracy (m.in. wyhamowywać nadmiernej ekscytacji innych neuronów) i pojawia się padaczka.
Modelowanie autyzmu u myszek
Na ilustracji po lewej stronie widzimy praktyczny przewodnik po tym jak rozpoznawać emocje u myszek. To, oczywiście, słaby żart, ale obrazuje z jakimi trudnościami borykają się badacze chcący ocenić czy dana mysz jest autystyczna i czy testowana ingerencja sprawia, że autystyczna przestaje być. Biorąc pod uwagę, że ocena czy ktoś jest autystyczny czy nie jest trudna w przypadku ludzi to co dopiero w przypadku myszek. Żeby przezwyciężyć wiele trudności badacze starają się opracowywać różne testy, które pozwalają odróżnić autystyczną mysz od takiej, która autyzmu nie ma. Dlaczego o tym tutaj piszę? Ano, niestety, badania profesora Catteralla dotyczą na razie gryzoni, a nie ludzi, więc jednak wypada coś na temat autyzmu u mysz powiedzieć. Pomijając fakt w jaki sposób badacze próbują wywołać autyzm u myszy przyjrzyjmy się pobieżnie w jaki sposób badacze sprawdzają czy rzeczywiście mysz jest autystyczna (albo przynajmniej, znacząco inna od normalnej). O tym poniżej.
Test otwartej przestrzeni
Jednym z osiowych zaburzeń w ASD jest sztywny schemat zachowań, wąski zakres wyuczonych zachowań, obawa przed nowością. W przypadku lepiej funkcjonujących osób z ASD często występuje niepokój, trwoga, bojaźliwość (ang. anxiety). Jednym z testów, który stara się badać nasilenie takich zachowań u gryzoni jest test otwartej przestrzeni (ang. open field test). Testowana mysz jest umieszczana w zamkniętym pojemniku nad którym znajduje się kamera. Normalna mysz spędza początkowo bardzo dużo czasu przy ściankach pomieszczenia bojąc się wyjść na otwartą przestrzeń z obawy przed czyhającym niebezpieczeństwem (które, w istocie, może jej grozić w warunkach naturalnych). Z biegiem czasu myszka nabiera pewności siebie, pokonuje wrodzoną bojaźliwość i eksploruje całą dostępną przestrzeń. Okazuje się, że autystyczna mysz przejawia inny schemat zachowań. Przebywa praktycznie cały czas w tym samym miejscu i w całym okresie badania nie eksploruje dostępnej przestrzeni. Oprócz tego, że autystyczna mysz nie przemieszcza się w sposób typowy dla gatunku to widać też inne nieprawidłowe zachowania: autystyczna mysz rzadko zatrzymuje się i obwąchuje otoczenie. Czy takie zachowanie myszki dobrze modeluje niektóre aspekty zachowań u dzieci z ASD? A może autystyczne myszy nie muszą się zachowywać dokładnie tak samo jak ludzie. Przyjrzyjmy się krótko jeszcze innym testom.
Test trzech komór
Celem testu przedstawionego na powyższym obrazku jest ocenia defektów społecznych u autystycznych myszek. Myszki są z natury bardzo społeczne i chętnie zaznajamiają się nowymi, nieznanymi im wcześniej myszkami. W eksperymencie z trzema komorami badaną mysz umieszcza się w środkowej komorze. W jednej z pozostałych komór znajduje się nieznana mysz, a ostatnia komora jest pusta. Jak się łatwo domyślić w przypadku typowej myszki dość szybko dochodzi do interakcji pomiędzy myszkami i badana mysz spędza dużo czasu w komorze, w której znajduje się nieznana jej mysz. Autystyczna mysz zachowuje się zgoła inaczej. Pierwszy kontakt z nieznaną myszką zachodzi nawet czterokrotnie później i czas spędzony z nową myszką jest o połowę mniejszy. Rozszerzeniem tego testu jest umieszczenie dwóch myszek w skrajnych komorach. Jedna z myszek jest znana testowanej myszce, a druga nie. Normalne myszki lubią nowości i więcej czasu spędzają z nieznaną im dotąd myszką. Autystyczna myszka zachowuje się inaczej.
Pozostałe testy
Testów, w których widać, że myszki u których wywołano autyzm zachowują się inaczej niż typowe myszki jest więcej. W przypadku niektórych testów łatwiej widać jak danych test może się przekładać na ludzkie zachowania, w przypadku innych testów jest to trochę trudniej dostrzegalne. Z pozostałych testów warto wymienić obserwacje tego jak myszka często się czyści (te autystyczne robią to znacząco częściej - być może odpowiada to rytualnym, schematycznym zachowaniom widocznym u ludzi z ASD) i test wymuszonego pływania (oceniająca czy myszka cierpi na depresję). Uniesiony labirynt w kształcie znaku plus w założeniu bada bojaźliwość u myszek (otwarte ramiona bez zabezpieczeń wydają się niebezpieczne). Jak to wygląda można zobaczyć na youtube. To co będziemy obserwować o gryzoni zależy też trochę od danej dysfunkcji, która spowodowała, że myszka jest autystyczna. W przypadku braku działania kanału Nav1.1 i zespołu Draveta obserwuje się ataksję. W związku z powyższym wydaje się, że naturalnym celem obserwacji wydaje się sprawdzenia czy myszka potrafi chodzić w linii prostej, czy też nie (być może właśnie z powodu ataksji).
Klonazepam
Klonazepam jest lekiem z grupy benzodiazepin, wykazującym silne działanie przeciwdrgawkowe. Między innymi z uwagi na to, że autyzm często występuje razem z padaczką ten lek jest stosowany także w przypadku osób autystycznych. Z uwagi na działanie uspokajające bywa przypisywany także w przypadkach kiedy u dziecka nie występuje padaczka. Długotrwałe przyjmowanie leku powoduje, że pojawia się tolerancja i trzeba stopniowo zwiększać dawkę. Leku nie można też gwałtownie odstawiać. Lista skutków ubocznych związanych z długotrwałym przyjmowaniem leku jest długa.
Okazuje się, że w zależności od dawki działanie klonazepamu może się diametralnie różnić.
Grupa badaczy w skład której wchodził prof. Catterall postanowiła zbadać działanie klonazepamu w mysim modelu Zespołu Draveta. Idea początkowo wydaje się dziwna, bo przecież klonazepam jest już od dawna przypisywany osobom z ASD. Dlaczego więc warto się nad tym pochylać? Kluczem jest tutaj odpowiednia dawka leku, znacząca mniejsza niż dotychczas, powodująca inne rezultaty. Oddajmy głos autorom, którzy najpierw starali się dokładnie scharakteryzować deficyty u ich myszek.
Homozygous Scn1a−/− mice developed severe ataxia and died on postnatal day (P) 15, whereas Scn1a+/− mice had spontaneous seizures and sporadic deaths beginning after P21. Scn1a+/− mice develop multiple behavioral phenotypes, which are phenocopies of comorbidities in DS. During a 10-min open-field test, adult Scn1a+/− mice traveled significantly longer than WT (Fig. 1a) but spent less time in the center of the open field (Fig. 1b, Supplementary Fig. 1). In the elevated plus maze, Scn1a+/− mice entered open arms less frequently compared with WT (Fig. 1c), and spent less time in the open arms (Fig. 1d, Supplementary Fig. 2). Scn1a+/− mice also spent more time self-grooming than WT (Fig. 1e, Supplementary Fig. 3a) and displayed increased circling behavior (Fig. 1f, Supplementary Fig. 3b). These observations indicate that Scn1a+/− mice exhibit hyperactivity, increased anxiety, and increased stereotyped behaviors, which are phenocopies of autistic traits in DS. Scn1a+/− mice also showed decreased nest-building ability compared to WT (Supplementary Fig. 4), which could indicate deficits in social behavior.
A three-chamber experiment showed that Scn1a+/− mice displayed profound deficits in social interaction.
However, when we put a stranger mouse in the cage in one chamber, WT mice spent more time in the mouse-containing chamber than in the empty cage-containing chamber (Fig. 1g, Supplementary Fig. 5), and interacted more extensively with peer mice than with the empty cage (Supplementary Fig. 7b). In contrast, Scn1a+/− mice displayed no preference for the stranger mouse (Fig.1g, Supplementary Fig. 5, 7b). When a second stranger mouse was placed in the unoccupied side chamber to assess the discrimination between a novel and a familiar mouse, WT mice showed strong preference for the novel mouse, but Scn1a+/− mice did not (Fig. 1h, Supplementary Fig. 5, 7c), even though they have preference for novel objects (see below).
Scn1a+/− mice failed to improve their learning performance during four days of training (Fig. 2d, e), and displayed substantially reduced spatial memory during the probe trials at day 5 (Fig. 2f – i). These data, together with the results of the context-dependent fear-conditioning test (Fig. 2c), indicate that Scn1a+/− mice have severely impaired spatial learning and memory.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3448848/
Widać z powyższego, że badacze w ocenie stanu myszek wykorzystali testy, które pobieżnie przedstawiliśmy wcześniej. Poza zachowaniami ze spektrum autyzmu myszki uczyły się też gorzej i miały gorszą pamięć. Myszkom podano klonazepam w mikrodawce. Konkluzja badaczy poniżej.
Given that the autism-related phenotype and spatial-learning deficit in Scn1a+/− mice emerge from decreased NaV1.1 activity in GABAergic interneurons, we reasoned that they could be rescued by increasing the strength of GABAergic transmission. To test this idea, we treated Scn1a+/− and WT mice with the benzodiazepine clonazepam, a positive allosteric modulator of the GABAA receptor. Benzodiazepines do not open the GABAA receptor chloride channel in the absence of GABA, but instead boost GABA signaling only when presynaptically released GABA binds to the receptor.
Both in the open arena and in the three-chamber test, clonazepam treatment completely rescued impaired social behaviors of the Scn1a+/− mice, and this effect was reversed after the one-week clearing period (Fig. 5b, c; Supplementary Fig. 22, 23). In contrast, low-dose clonazepam had no effect on the social behavior of WT mice. Treatment with low-dose clonazepam 30 min before testing also rescued impaired context-dependent fear conditioning. Whereas WT mice were unaffected by clonazepam (Fig. 5d), Scn1a+/− mice displayed a complete reversal of the loss of their 30-min and 24-h contextual fear memory (Fig. 5e). These results indicate that a single low dose of clonazepam can reversibly rescue core autistic traits and cognitive deficit in Scn1a+/− mice.
These results support our hypothesis that behavioral rescue by treatment with clonazepam is associated with increased strength of inhibitory transmission.
High-dose benzodiazepine has been widely used to alleviate epileptic seizure and anxiety-like behaviors, but not for rescuing major autism-related behaviors because of its sedative effects. Remarkably, a single low-dose clonazepam injection completely rescued deficits in social interactions and fear-associated contextual memory without sedative or anxiolytic effects in Scn1a+/− mice. The reversible rescue of cognitive deficit and autism-related behaviors by clonazepam at the time of training implies that these comorbidities in DS mice are not caused by recurrent seizure-induced excitotoxicity, but instead are caused by Scn1a haploinsufficiency and the resulting reduction of GABAergic transmission. These results suggest that low-dose benzodiazepine treatment could be a potential pharmacological intervention for cognitive deficit and autistic symptoms in DS patients.
Our results suggest that low-dose benzodiazepine treatment may be effective in alleviating these autistic traits and cognitive impairment in DS and possibly in ASDs more broadly.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3448848/
Badacze sugerują, że nie tylko udało im się spowodować, że myszki przestały się zachowywać w autystyczny sposób, ale też stały się mądrzejsze. To szalenie ważne. Jak daleko jest ten eksperyment na myszkach od skutecznej terapii u ludzi? Być może niedaleko. Okazuje się, że istnieje już pewna grupa osób, które spróbowały podobnej interwencji. Niektóre z tych osób piszą o wyjątkowo pozytywnych efektach. Ponieważ klonazepam bywa często przypisywany w przypadku autyzmy (przynajmniej w Stanach) to jest spora szansa, że niektóre dzieci i tak miałyby przypisany ten lek. Jeśliby chcieć pójść droga prof. Catterall to dawka tego leku jest kilkanaście-kilkadziesiąt razy mniejsza niż to co wynika z ulotki. Zapewne lekarz zasugeruje, że w takiej dawce lek będzie zupełnie nieskuteczny. A może wręcz przeciwnie. Wydaje się, że takie małe dawki wyraźnie zmniejszają ryzyko pojawiania się efektów ubocznych, ale tutaj trzeba przeprowadzić badania. W praktyce okazuje się, że największym problem jest tutaj dawkowanie (bo np.: trzeba podać 1/20 tabletki) i to, że jest bardzo wąski zakres dawki w jakiej ten lek może być skuteczny. Tutaj jednak nie będę przepisywał tego co już zostało napisane lecz odsyłam bezpośrednio do blogu Petera (którego aktualny blog jest jedynie namiastką): [6], [7], [8].
Konkluzja
Zaburzenia w funkcjonowaniu kanałów sodowych powodują różnych obraz kliniczny. Obserwuje się zarówno encefalopatię połączoną z epilepsją jak i autyzm z niepełnosprawnością intelektualną. Ale te obserwowane fenotypy nie są do końca rozłączne. W przypadku autyzmy spowodowanego dysfunkcją kanałów sodowych też mamy czasem do czynienia z padaczką, a z drugiej strony osoby z encefalopatią wykazują wiele zachowań ze spektrum. Okazuje się, że intuicja bywa zawodna i brak przewodnictwa kanałów sodowych może paradoksalnie skutkować padaczką. To co jest najważniejsze w tym poście to to, że dysfunkcję kanałów sodowych można niwelować prowadząc interwencje, które nie są wycelowane w niepracujące właściwie kanały. Nierównowagę pomiędzy ekscytacją/inhibicją można próbować niwelować zarówno poprzez zmniejszanie ekscytacji jak i poprzez zwiększanie inhibicji. Nie jest to trywialne albowiem nadmierna inhibicja w jednym rejonie mózgu może powodować nadmierną ekscytację w innym rejonie (jak przypadku Zespołu Draveta). Wykorzystywane od dziesięcioleci leki mają znany profil bezpieczeństwa. Nawet jeśli ten profil bezpieczeństwa nie jest korzystny to jest on dobrze rozpoznany i wiadomo mniej więcej czego się spodziewać. Bywa tak, że różne dawki tego samego leku działają w inny sposób. Jeden z takich przykładów dotyczył klonazepamu i był przedmiotem badań na mysim modelu Zespołu Draveta. Chociaż rezultaty są obiecujące to prawdopodobnie potrzeba trochę czasu zanim zostanie podjęta próba na ludziach.
[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3448848/
[2] http://www.ice-epilepsy.org/the-sodium-channel-and-morbidities-associated-with-dravet-syndrome.html
[3] http://www.cco.caltech.edu/~phplab/images/whatwedo/EngSci31006.pdf
[4] https://pl.wikipedia.org/wiki/Klonazepam
[5] https://www.youtube.com/watch?v=VuWWtqxe9rM
[6] https://epiphanyasd.blogspot.com/2015/12/long-term-use-of-low-dose-clonazepam.html
[7] https://epiphanyasd.blogspot.com/2014/03/channelopathies-in-autism-treating.html
[8] https://epiphanyasd.blogspot.com/2015/08/low-dose-clonazepam-for-autism-sfari.html
