Chodzenie na palcach

Zacznijmy od cytatu.

Toe walking is a physical sign associated with several diagnoses such as spastic cerebral palsy, spinal dysraphism/injury, myopathy, neuropathy, autism, and pervasive developmental disorder. In other children the cause of toe walking remains unknown. They are given the diagnosis of idiopathic toe walking (also called habitual toe walking). This is a diagnosis of exclusion in which the aforementioned causes have been ruled out.

In the developmental pediatric literature, Accardo and Whitman⁶ systematically examined the relationship between toe walking and language development in 799 children referred for developmental evaluation. They found that the frequency of toe walking increased as the severity of language impairment increased. Subsequently, Accardo et al.⁷ reported a 24% incidence of toe walking in a general pediatric population. A trend of lower mean language quotients was found for the children who toe-walked compared with those who did not.

Shulman i wsp. "Developmental implications of idiopathic toe walking"

Autorzy publikacji, z której pochodzi powyższy fragment, sugerują że chodzenie na palcach należy traktować jako sygnał ostrzegawczy, mogący zwiastować pojawienie się dodatkowych problemów w przyszłości. Zauważają też, że chodzenie na palcach najczęściej obserwowane jest u osób z autyzmem, a w dalszej kolejności u osób z zaburzeniami komunikacji, niepełnosprawnością umysłową oraz problemami z nauką. Ponieważ z przytoczonego powyżej cytatu wynika, że nawet do 24% dzieci na pewnym etapie rozwoju może chodzić na palcach to zachodzi pytanie, kiedy chodzenie na palcach powinno niepokoić? Na tak postawione pytanie odpowiedzi udzielają autorzy kolejnej publikacji.

When children learn to walk a toe-to-toe gait pattern is considered part of the normal gait development. However if toe-walking persists after the age of 2 years a possible underlying disorder should be excluded.^1,2

T.K. Klooker and F.A.B.A. Schuerman "Idiopathic toe-walking"

Przyjrzyjmy się zatem temu co może powodować chodzenie na palcach u dzieci starając się (często na siłę) podciągnąć to pod szeroki parasol możliwych zaburzeń występujących w ASD.

Ktoś może zadać pytanie dlaczego należy zajmować się tym zagadnieniem? Chodzenie na palcach nie jest zaliczane przecież do osiowych zaburzeń występujących w autyzmie. Mamy jednak nadzieje znaleźć w literaturze pewne wskazówki sugerujące co może być przyczyną chodzenia na placach - wyjaśnienie, że przyczyną jest autyzm nas nie zadowala. Być może niektóre z tych przyczyn da się usunąć.

Tryptofan

Zainteresowanie tematem serotoniny w kontekście autyzmu po raz pierwszy pojawiło się w latach 70-tych kiedy to okazało się, że poziom serotoniny we krwi jest podwyższony u osób z autyzmem[1]. Zauważono też odmienne poziomy serotoniny i innych metabolitów w moczu osób autystycznych w porównaniu z grupą dzieci z łagodną niepełnosprawnością umysłową. Entuzjazm związany z tym odkryciem słabł z czasem kiedy to okazywało się, że poziom 5HIAA (metabolitu serotoniny) u osób autystycznych nie różni się statystycznie od poziomu obserwowanego u osób zdrowych[2]. Pomimo tego, że procesy związane z wychwytem, transportem i składowaniem są takie same zarówno dla serotoniny w mózgu jak i w pozostałych organach to jednak serotonina powstająca w komórkach nerwowych mózgu pełni inną rolę niż ta powstająca w przewodzie pokarmowym (odpowiednio rola neuroprzekaźnika i regulatora pracy przewodu pokarmowego). W związku z powyższym wartości oznaczane w mózgu i krwi nie muszą ze sobą korelować[3]. Chociaż nie uzyskano jeszcze konsensusu co do tego, czy wartości serotoniny we krwi i mózgu ze sobą korelują to powszechnie uważa się, że około 30% osób z autyzmem ma podwyższone wartości serotoniny we krwi pomimo tego, że badania pokazują, że poziom 5HIAA jest raczej normalny lub niższy u osób z autyzmem w porównaniu do grupy kontrolnej.

Badania pokazują, że ilość serotoniny w mózgu jest do pewnego stopnia zależna od ilości spożywanego tryptofanu[4]. Zmniejszanie lub zwiększanie ilości tryptofanu przyjmowanego w diecie powoduje u zwierząt laboratoryjnych odpowiednio zmniejszenie lub zwiększenie poziomu serotoniny w mózgu. Co więcej, niższy poziom tryptofanu w diecie może pociągać za sobą zwiększone odczuwanie bólu (obserwowane czasem u osób z ASD). W kontrolowanej, ślepej próbie polegającej na krótkotrwałej redukcji spożywanego tryptofanu u dorosłej osoby z autyzmem zauważono znaczące nasilenie symptomów (depresji, złości, irytacji, niepokoju) w okresie, w którym osoba spożywała mniej tryptofanu w diecie.[5]

Korzystając z powyższych obserwacji Christopher J. McDougle i wsp. postanowili w kontrolowanej, ślepej próbie sprawdzić jaki wpływ u dorosłych, autystycznych osób będzie miała krótkotrwała dieta z niską zawartością tryptofanu[6]. Zachowania, które postanowiono monitorować to: kręcenie się, trzepotanie rękami, chodzenie do przodu i do tyłu połączone z ekscytacją, uderzanie siebie, kołysanie się oraz chodzenie na palcach. Badano ilość takich zachowań w okresie pięciu godzin. Co się okazało? Dieta uboga w tryptofan powodowała nasilenie wspomnianych zachowań u 65% osób (11 osób z 17) - nie obserwowano nasilenia takich zachowań w grupie osób otrzymujących dietę z zachowaną ilością tryptofanu. Brak tryptofanu powodował pojawienie się niepokojących zachowań zwłaszcza u osób gorzej funkcjonujących (z wyższą punktacją w teście ABC). Co więcej, zaobserwowano, że pogorszenie następowało częściej u osób, które miały wysoki poziom bazowy tryptofanu (zanim wprowadzenie diety, nie obniżyło tego poziomu). Zmiana zachowania nie była skorelowana z IQ. Zauważono też, że nasilenie ograniczonego zakresu myśli i zachowań (korowe zaburzenie w autyzmie) nie uległo zmianie pomimo diety.

The short-term depletion of TRYP, and presumably brain 5-HT, resulted in a significant worsening of behavioral symptoms in 65% of patients with autistic disorder who participated in this controlled study. However, short-term TRYP depletion may have affected neuropeptides, second messenger systems, receptor synthesis, or some other nonspecific aspect of brain function. Moreover, it is possible that TRYP depletion and the consequent reduction of 5-HT may have altered some critical balance between 5-HT and other neurotransmitter systems (eg, dopamine and norepinephrine).

Short-term TRYP depletion led to a significant increase in a number of behaviors characteristic of autism, including whirling, flapping, pacing, banging and hitting self, rocking, and toe walking. In addition, patients were significantly less calm and happy and more anxious after short-term TRYP depletion compared with sham testing.

McDougle CJ i wsp. "Effects of tryptophan depletion in drug-free adults with autistic disorder"

Czy jest możliwe jeszcze jakieś inne wyjaśnienie nasilenia chodzenia na palcach w przypadku deficytu tryptofanu niż obniżenie poziomu serotoniny w mózgu? Biorąc pod uwagę, że 95-99% spożywanego tryptofanu trafia na ścieżkę kinureniny (a nie serotoniny) to zapewne tak. Badania dotyczące nieprawidłowości związanych ze ścieżką kinureniny w przypadku osób z autyzmem pokazują, że także tutaj pewne rzeczy obserwowane u osób z autyzmem mają się inaczej niż w przypadku osób zdrowych[7]. Kto wie, czy deficyt tryptofanu nie potęguje jakiegoś zaburzenia na tej ścieżce u niektórych osób z ASD. Należałoby by jeszcze zapytać, czy osoby, których dieta nie jest uboga w tryptofan nie odniosłyby korzyści z suplementacji tryptofanem lub 5-HTP? Kto wie. Wydaje się, że zaobserwowanie nasilenia objawów podczas diety ubogiej w tryptofan lub zmniejszenia objawów podczas podawania 5-HTP może sugerować jakiś defekt na szlaku tryptofanu u dziecka.

Kanałopatia

Temat kanałopatii często przeplata się z tematem autyzmu (nawet na tym blogu). Niektóre nieprawidłowości związane z pracą kanałów jonowych skutkują zachowaniami ze spektrum autyzmu. W bazie danych SFARI można odnaleźć następujące geny związane z kanałopatią (a powodujące autyzm): CACNA1C, SCN2A, CACNA1H, CACNA2D3, CACNA1D, CACNA1E, CACNB2. Lista z pewnością nie jest pełna i należy się spodziewać, że w przyszłości będzie rozszerzana.

Poniższy raport opisuje chłopca u którego wykryto nową mutację związaną z kanałem potasowym Kv1.1 a skutkującą miokimią (mimowolnym ruchem poszczególnych włókien mięśniowych, lecz nie na tyle silnym aby spowodować ruch kończyny). Co ciekawe, badacze sugerują, że okresowe zmiany związane z pH lub poziomem elektrolitów mogły powodować nasilenie objawów związanych z kanałami potasowi i w konsekwencji skutkować chodzeniem na palcach.

A 3-year-old boy, whose only previous problem had been intermittent toe walking, presented with an inability to walk, in association with a 24h vomiting illness.

Within 24h his vomiting settled and he could walk with a toe-toe gait. Creatine kinase fell to normal.

A year later, on a field trip to the Outer Hebrides, the muscle hypertrophy was more pronounced, and he ran with a toe-toe gait.

The proband and his father have a novel point mutation within codon 244 of the Kvl.l gene replacing proline with histidine in the second transmembrane domain of the channel subunit.

Conclusion: Familial generalized myokymia may be a potassium channelopathy. The proband’s acute illness could be explained by subtle pH or electrolyte changes aggravating channel dysfunction, thus leading to peripheral nerve hyperexcitability. The manifestations of this mutation are myokymia, muscle hypertrophy and toe walking. We propose that some cases of toe walking are because of ion channelopathies.

S.M. Zuberi i wsp. "Familial generalized myokymia: A new potassium channelopathy"

Inna grupa sugeruje, że chodzenie na palcach może być objawem Zespółu Isaacsa-Mertensa (ang: neuromyotonia) i postępowanie sprowadza się wtedy do podawania leków oddziałujących na kanały sodowe.

Muscle stiffness is a more sustained continuous muscle contraction, which is present at rest. Slow moving with clawing of the fingers, toe walking and stiffness of proximal and axial muscles may occur (neuromyotonia). This disorder may be treated with drugs, which influence sodium channel (phenytoin, carbamazepine).

LA Weisberg, C Garcia, R Strub "Essentials of Clinical Neurology: Diseases of Muscle and Neuromuscular Junction"

Poniższa publikacja także wiąże chodzenie na palcach z dysfunkcjami kanałów jonowych.

A voltage gated potassium channel, Kv1.1, is expressed in cerebral cortex, cerebellum, and peripheral nerve. Channel dysfunction is reflected in symptoms related to each region. Mutations in this gene cause episodic ataxia type 1 (EA1).¹⁵ Affected individuals have cerebellar ataxia lasting seconds or minutes, precipitated by sudden movement or emotion. Hyperexcitability of peripheral nerves causes subtle, rippling muscle movements (myokymia) and in more severe cases neuromyotonia and flexion contractures of limbs, so infants may be misdiagnosed as having cerebral palsy. Some individuals have epilepsy reflecting cortical dysfunction.¹⁶ There is considerable variability in the phenotypic expression of mutations in this gene, such that presentation may vary from “idiopathic” toe walking to complex partial epileptic seizures.¹⁷

S Zuberi, M Hanna "Ion channels and neurology"

Stres oksydacyjny

Pod pojęciem stresu oksydacyjnego kryje się brak równowagi pomiędzy powstawaniem wolnych rodników (i produktów ulegających pod ich wpływem zniszczeniu) a możliwościami organizmu do usuwania wspomnianych substancji. Wiele już zostało powiedziane na temat stresu oksydacyjnego w autyzmie, wystarczy chociażby przewertować książkę "Autism: Oxidative Stress, Inflammation, and Immune Abnormalities". Okazuje się, że stres oksydacyjny może być spowodowany wieloma czynnikami. W przypadku poniższego badania badacze wywołali stres oksydacyjny u gryzoni i zaobserwowali pewne zachowania występujące u osób z autyzmem (między innymi chodzenie na palcach).

Oxidation of proteins by reactive oxygen species is associated with aging, oxidative stress, and many diseases. Although free and protein-bound methionine residues are particularly sensitive to oxidation to methionine sulfoxide derivatives, these oxidations are readily repaired by the action of methionine sulfoxide reductase (MsrA). To gain a better understanding of the biological roles of MsrA in metabolism, we have created a strain of mouse that lacks the MsrA gene. Compared with the wild type, this mutant: (i) exhibits enhanced sensitivity to oxidative stress (exposure to 100% oxygen); (ii) has a shorter lifespan under both normal and hyperoxic conditions; (iii) develops an atypical (tip-toe) walking pattern after 6 months of age; (iv) accumulates higher tissue levels of oxidized protein (carbonyl derivatives) under oxidative stress; and (v) is less able to up-regulate expression of thioredoxin reductase under oxidative stress.

Moskovitz J i wsp. "Methionine sulfoxide reductase (MsrA) is a regulator of antioxidant defense and lifespan in mammals"

Ponieważ ekspresja różnych genów może być odmienna w różnych narządach to nie zawsze stres oksydacyjny musi oznaczać to samo. Dla przykładu wyłączenie genu MsrB1 nie skutkowało już chodzeniem na palcach u gryzoni jak to miało miejsce w przypadku wyłączenia genu MsrA.

Knock-out of the MsrA gene in mice was described several years ago (16). The lack of MsrA results in the accumulation of carbonyl derivatives (indicative of protein oxidation) (17), increased susceptibility to exposure to 100% oxygen, and various neurological abnormalities, such as tip-toe walking, abnormal behavior, and lower locomotor activity (16, 18, 19).

We also did not observe a tip-toe walking behavior in young and middle-aged MsrB1 KO mice. Thus, there are important differences between MsrA KO and MsrB1 KO mice.

Liver and kidney of the MsrB1 knock-out mice also showed increased levels of malondialdehyde, protein carbonyls, protein methionine sulfoxide, and oxidized glutathione as well as reduced levels of free and protein thiols, whereas these parameters were little changed in other organs examined.

Fomenko DE i wsp. "MsrB1 (methionine-R-sulfoxide reductase 1) knock-out mice: roles of MsrB1 in redox regulation and identification of a novel selenoprotein form"

Wydaje się zatem, że myszki z deficytem MsrA prezentują bardziej wyraziste objawy neurologiczne w porównaniu do myszek z deficytem MsrB.

Several mechanisms are available to deal with oxidatively damaged proteins. If methionine residues have been oxidized by RS to methionine sulfoxide (a frequent fate of this amino acid), the damage can be ‘repaired’ by methionine sulfoxide reductase (Msr) enzymes, which convert methionine sulfoxide in peptides or proteins back to methionine and thus reactivate proteins inhibited by methionine oxidation. Methionine sulfoxide has two stereoisomers, and reductases specific for each form (R or S) have been identified; MsrA (sometimes called MsrS) acts on the S-isomer and MsrB (MsrR) is specific for the R-isomer. The reducing power is supplied by thioredoxin. MsrA has an essential cysteine residue at its active site. In some animal MsrB enzymes, a selenocysteine plays the same role (Moskovitz and Stadtman 2003). Both MrsA and B are found in brain; MsrA-deficient mice show a peculiar neurological phenotype, ‘tip-toe walking’ (Moskovitz and Stadtman 2003).

Barry Halliwell "Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now?"

Niestety, badacze nie próbowali obniżać farmakologicznie poziomu stresu oksydacyjnego u myszek z wyłączonym genem, w związku z czym nie wiemy, czy mogłoby to mieć wpływ na widoczne zachowania ze spektrum (m.in. chodzenie na palcach). Chociaż nie jest to pewne, to nie można jednak wykluczyć, że taka interwencja miałby szansę zadziałać.

Inni badacze, Karen M. Doyle i Graham G. Shaw postanowili sprawdzić jaki będzie efekt wstrzyknięcia spermidyny do mózgu myszek[14]. Okazało się, że myszki zaczęły chodzić na palcach. Jako, że spermidyna powoduje aktywację receptorów NMDA to badacze postanowili sprawdzić, czy ta ścieżka jest odpowiedzialna za obserwowane zachowanie. Testy z wykorzystaniem ifenprodylu (inhibitora receptora NMDA) wykazały, że prawdopodobny mechanizm jest inny. Badacze zasugerowali, że przyczyną chodzenia na palcach był prawdopodobnie stres oksydacyjny wywołany przez nadtlenek wodoru.

Injection of 100 ug of spermidine into the cerebral ventricles of mice results within 2 - 4 days of injection in the development of a characteristic neurotoxic syndrome[1]. The first behavioural signs are the development of high carriage or an abnormal gait with signs of digit splaying. These effects then progress to a characteristic "tip-toe walking" behaviour, which involves walking with an arched back, and severe splaying of digits.

These findings suggest that spermidine induced neurotoxicity is not mediated by NMDA receptor activation, and implicate a metabolite generated via the retroconversion pathway, probably hydrogen peroxide.

Karen M. Doyle i Graham G. Shaw The mechanism of the neurotoxic effects of spennidine

Stres oksydacyjny jest czymś co bardzo często towarzyszy autyzmowi. Istnieją badania pozwalające sprawdzić, czy stres oksydacyjny występuje. Istnieją także publikacje sugerujące, że obniżenia stresu oksydacyjnego u osób z ASD (czy to za pomocą MB12, czy to za pomocą NAC) poprawiają funkcjonowanie tych osób. Czy można liczyć, że ustępuje wtedy chodzenie na palcach? Nie jest to wykluczone. Wydaje się, że w przypadku zaobserwowania chodzenia na palcach u dziecka z ASD warto spróbować sprawdzić poziom stresu oksydacyjnego w organizmie.

Selen

Kolejny temat wydaje się do pewnego stopnia łączyć z poprzednim. Selen pełni różne funkcje w organizmie, ale przytaczając wikipedię "najważniejszą jego funkcją jest tworzenie silnego antyutleniacza, enzymu zwanego peroksydazą glutationową"[12]. Pan Jackob Moskovitz i Earl R. Stadtman postanowili sprawdzić jaki wpływ na funkcjonowanie myszek będzie miała dieta uboga w selen. Okazało się, że pojawiło się charakterystyczne chodzenie na palcach. Chociaż nie można wykluczyć innych możliwości to jednak badacze stoją na pozycji, że to jednak stres oksydacyjny wywołany przez brak wystarczającej ilości selenu spowodował to zachowanie. Wydaje się więc, że wywołując stres oksydacyjny na różne sposoby możemy spodziewać się pojawienia wspólnych zachowań.

Furthermore, the development of the ‘‘tip-toe’’ walking behavior previously observed in the MsrA / mice occurred earlier when they were fed with the SD diet.

It was shown earlier that MsrA null mice exhibited a characteristic tip-toe walking behavior after 6 months of age (9), which was interpreted to indicate possible development of a neurological disorder. In the present study, it was found that onset of the tip-toe walking characteristic in the SD mice occurred 3 months earlier than previously observed(9).

Of particular interest is the fact that the Msr activities in the brain’s cerebrum and cerebellum are considerably lower than those in either the kidney or liver. This difference likely accounts for the fact that the accumulation of protein-MetO in brain tissues is significantly greater than in the other tissues examined (Fig. 3) and calls attention to the possibility that the elevated level of Met oxidation especially in the cerebellum of the MT brain under the SD diet (Fig. 3) underlies the neurological disturbance responsible for the early, age-related onset of tip-toe walking behavior. It is important to note that methionine oxidation occurring under SD diet is primarily the result of selenium depletion, whereas during the aging process many factors could influence the levels of protein-bound MetO. Therefore, the difference in protein-MetO level between WT and MT brain cerebellums (under SD diet) probably is due to selenium depletion-related oxidative stress imposed on MT brains (Fig. 3). Obviously, more research is needed to better understand the physiological events involved in triggering the enhanced protein oxidation in the MT brain.

Jackob Moskovitz, Earl R. Stadtman "Selenium-deficient diet enhances protein oxidation and affects methionine sulfoxide reductase (MsrB) protein level in certain mouse tissues"

Mózgowe porażenie dziecięce

Mózgowe porażenie dziecięce jest spowodowane nieprawidłowościami w rozwoju mózgu lub uszkodzeniem tych jego części, które są odpowiedzialne za koordynację wzrokowo-ruchową, równowagę i postawę[1][2].

Czynniki ryzyka to przedterminowy poród, ciąża wielopłodowa, niektóre infekcje przebyte podczas ciąży, takie jak toksoplazmoza, różyczka, ekspozycja na metylortęć, oraz uraz głowy przebyty w czasie pierwszych kilku lat życia i inne.

Mózgowe porażenie dziecięce @ wikipedia

Okazuje się że chodzenie na palcach jest jednym z objawów mózgowego porażenia dziecięcego (ang. cerebral palsy). Wielu badaczy postuluje, że ekscytotoksyczność spowodowana nadmiernym pobudzeniem receptorów reagujących na kwas glutaminowy i stres oksydacyjny są w tym przypadku kluczowe[16]. Ponieważ w mózgowym porażeniu dziecięcym chodzenie na placach spowodowane jest prawdopodobnie spastycznością to jednym ze stosowanych leków jest baclofen. Uważa się, że baclofen jest w tym przypadku skuteczny ponieważ zmniejsza ilość kwasu glutaminowego w synapsach poprzez poburzenie receptorów GABA_B. Brzmi znajomo? Baclofen stosowany był także w przypadku dzieci z łamliwym chromosomem X. Przesłanki do jego stosowania były podobne, chciano uzyskać zmniejszenie pobudzenia receptorów mGlur5 poprzez zmniejszenie ilości kwasu glutaminowego w synapsach. Chociaż badania nie monitorowały chodzenia na palcach nie można wykluczyć, że także w przypadku osób z FXS (i ogólnie w przypadku osób z autyzmem) podawanie baclofenu (lub phenibutu) może zredukować chodzenie na palcach.

Intrathecal baclofen therapy uses an implantable pump to deliver baclofen, a muscle relaxant, into the fluid surrounding the spinal cord. Baclofen decreases the excitability of nerve cells in the spinal cord, which then reduces muscle spasticity throughout the body.

Cerebral Palsy: Hope Through Research

Puryny

Zaburzenia na szlaku puryn mogą nieść bardzo poważne konsekwencje, przykładem niech będzie Zespół Lescha-Nyhana. Okazuje się, że prawdopodobnie pewna podgrupa osób ze zdiagnozowanym autyzmem posiada jakiś defekt na szlaku puryn. Badacze doszli do takich wniosków dzięki badaniom, które unaoczniły fakt, że u dzieci z autyzmem znacząco częściej niż w grupie kontrolnej mamy do czynienia z podniesionym powyżej górnej granicy zakresu referencyjnego kwasem moczowym. Jednocześnie, zaburzenia nie są na tyle poważne żeby powodować takie objawy jak kamienie nerkowe czy dna moczanowa. Poziom kwasu moczowego we krwi jest także w normie. W poniższej publikacji badacze postanowili przyjrzeć się grupie dzieci z symptomami ze spektrum i zwiększoną produkcją kwasu moczowego. Poza typowymi dla autyzmu osiowymi zaburzeniami obserwowano także takie zachowania jak chodzenie na palcach.

Despite the prominent increase in uric acid production, plasma concentration of urate in most cases is within the normal range, and there is no evidence of urate pathology such as gout or kidney stones.

The subjects for this study were chosen for the presence of both classic autistic symptoms and uric acid production greater than 2 S.D.s above the normal mean.

All the patients exhibited typical autistic symptoms, including lack of interest in social contact, severely restricted communicative ability, and lack of imaginative activity. In every case these symptoms were apparent by the third year. Stereotypic behavior was seen in all patients and consisted of twirling, repetitive motions, toe-walking, and hand-£apping.

The hyperuricosuric autistic subjects appear to have a more modest 2-3-fold increase in urate production and 3-4-fold increase in de novo purine synthesis, as measured in their cultured fibroblasts. These individuals do not usually have elevated plasma uric acid, and rarely experience any type of urate pathology. Apparently, removal of urate by the kidneys is adequate in the case of this smaller increase.

Theodore Page, Mary Coleman Purine metabolism abnormalities in a hyperuricosuric subclass of autism

Powstaje zatem pytanie, czy zwiększony poziom kwasu moczowego w moczu jest czymś co może mieć potencjalny wpływ na zachowanie, czy też można to zbagatelizować. W kolejnym fragmencie publikacji mamy zaprezentowany przykład dziecka, którego zachowania są w dużej mierze zbieżne z zachowaniami dzieci autystycznych (aczkolwiek, dziecko zostało zdiagnozowane jako schizofreniczne). Okazuje się, że podanie dziecku allopurynolu (który zmniejsza wydzielanie kwasu moczowego) spowodowało, że wiele z jego niepokojących zachowań minęło, w tym chodzenie na palcach.

After age 2, speech began to regress, although it was never completely lost. He gradually developed bizarre or echolalic speech in a parrotlike tone of voice. Echolalia was present in over 90% of speech. When he was older he made clicking sounds or ground his teeth when speaking. He developed pica for chalk, paint, dirt, and especially wild onions in the yard and began biting his wrists and sucking his lips until abrasions appeared. He developed marked hyperactivity, began banging his head, rocking himself, whirling objects, and rolling himself down inclines. He was a toe-walker at times. He began resisting any change in furniture, food, clothes, or routine. He developed precise, complicated rituals at bedtime and meals and became fearful of certain animals.

After initiation of this therapy, a gradual change occurred in the patient in the ensuing months. He stopped biting his hands and legs, stopped toe-walking, appeared more alert, and gradually began speaking more and more spontaneously with less and less echolalia.

Coleman M. A crossover study of allopurinol administration to a schizophrenic child

Kolejny przykład dotyczy dorosłego już pacjenta (także chodzącego na palcach), u którego poziom kwasu moczowego w moczu był powyżej 5-ciu odchyleń standardowych powyżej normy. Pacjentowi zaaplikowano urydynę i zauważono dramatyczną poprawę, między innymi w motoryce (choć, nie podano, czy chodzenie na palcach ustąpiło). Odstawienie urydyny powodowało regres.

The patient, a left-handed Caucasian male, was first studied at age 9 years for speech, behavior, motor, and cognitive abnormalities. His birth and neonatal period were unremarkable. As a small child, he began head banging, crib rocking, hand flapping, and toe walking, and these were present at his examination at age 9.

Measurement of urinary uric acid gave a value of 18.1 mg/kg/day at age 9 years. This is nearly 5 S.D. above the normal mean of 8.3 ± 2.0 for this age group.

The patient began treatment with oral uridine at age 32.

Dramatic improvement was noted in virtually every area of deficit.

Withdrawal of uridine for more than 72 h caused some regression. He noted that he had difficulty concentrating and his speech, gait, and fine motor control appeared to deteriorate. Resumption of uridine restored the benefits he had gained over the course of the trial. At present, the patient has been taking oral uridine for more than 2 years. No adverse effects have been noted during this time.

Theodore Page, Charles Moseley Metabolic treatment of hyperuricosuric autism

Trudno jednoznacznie ocenić na ile obserwowana zwiększona ilość kwasu moczowego w dobowej zbiórce moczu może sugerować jakieś zaburzenia na szlaku puryn i tłumaczyć zachowania ze spektrum. Wydaje się jednak, że nie można wykluczyć tutaj tego, że przynajmniej w niektórych przypadkach pewne zachowania ze spektrum są jakoś powiązane z tym, że przekroczona jest norma kwasu moczowego w moczu.

Kinaza kreatynowa

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a to genetycznie warunkowana choroba powodująca postępujący i nieodwracalny zanik mięśni. Dzieci z tą chorobą często chodzą na palcach. Badaniem, które może skierować podejrzenia lekarza w kierunku tej choroby jest kinaza kreatynowa. Wartości dla osób z tą chorobą są często 10-100 powyżej górnej granicy zakresu referencyjnego. Po co bada się poziom kinazy kreatynowej? Przytoczmy to co można przeczytać na wikipedii: "Podwyższony poziom CK świadczy przede wszystkim o uszkodzeniu tkanek, szczególnie mięśni. Oznacza zatem kontuzje, nadmierny wysiłek fizyczny, choroby mięśnia sercowego, zawał serca, choroby ośrodkowego układu nerwowego, wylewy, napady epileptyczne lub intensywną radioterapię. Może również pojawiać się na przykład przy niedoczynności tarczycy lub w chorobach mięśni, a czasami (ok 1% przypadków) także przy zażywaniu leków z grupy statyn, obniżających stężenie cholesterolu we krwi"[13]. Dlaczego o tym piszemy? Nie, nie sugerujemy tutaj, że osoby z autyzmem mają także dystrofię mięśniową Duchenne’a, ale okazuje się, że z bliżej nieokreślonych powodów osoby te mają podwyższony poziom kinazy kreatynowej we krwi? Spójrzmy.

Too few laboratory values for the serum creatine kinase level were available from control subjects to directly compare this laboratory value between autistic and control patients. However, the number of abnormal serum creatine kinase level values was unusually high for the autistic group (22 of 46 [47%]; binomial probability: P < 1 × 10⁻¹⁴).

Our findings of mildly increased aspartate aminotransferase and serum creatine kinase level in children with autism might reflect abnormal mitochondrial function in skeletal muscle since alanine transaminase and other liver enzymes were normal. Without muscle biopsy data, it is not entirely possible for us to exclude that false-positive laboratory results contribute to our high rate of aspartate aminotransferase and serum creatine kinase level abnormalities. As pointed out by others, children who struggle during venipuncture can skew the results of blood analysis.¹¹

Poling JS i wsp. "Developmental regression and mitochondrial dysfunction in a child with autism"

Co prawda badacze nie dają jednoznacznej odpowiedzi, ale sugerują, że podwyższony poziom kinazy kreatynowej u autystów może wskazywać na jakieś defekty w funkcjonowaniu mitochondriów. W podobnym tonie wypowiadają się autorzy kolejnej pracy. Czy poziom kinazy kreatynowa koreluje z częstotliwością chodzenia na palcach? Na to pytanie nie znaleźliśmy jednoznacznej odpowiedzi.

We also found high levels of creatine kinase-MB at younger ages, consistent with the findings of a previous study in children with ASD [47]. However, we found that the levels of creatine kinase decreased with age, which suggests that progressive effects may occur in energy metabolism or related pathways in ASD. This could be linked to mitochondrial dysfunction and oxidative stress that has been associated with the etiology of autism [21].

Jordan M Ramsey i wsp. "Identification of an age-dependent biomarker signature in children and adolescents with autism spectrum disorders"

Czy podniesiony poziom kinaza kreatynowa może sugerować jakiś subtelny (i wtórny?) defekt metaboliczny? Nie jest to wykluczone. Dzieci z ASD mają zdecydowanie częściej niż ich zdrowi rówieśnicy przekroczone pewne markery wykorzystywane w diagnostyce zaburzeń metabolicznych (np.: kwas mlekowy we krwi). Interwencją, którą można rozważyć w takim przypadku są suplementy mające usprawnić/wspomóc pracę mitochondriów.

Stan zapalny mięśni (myositis)

Kolejny przykład chodzenia na palcach dość mocno odbiega od autyzmu. Wydaje się, że niektóre infekcje (które mogą występować częściej u osób z ASD) skutkują chodzeniem na palcach. W przypadku osób z ASD mamy do czynienie ze sporą ilością różnych zaburzeń układu odpornościowego i być może (spekulujemy) niektóre z tych zaburzeń predysponują te dzieci bardziej do chodzenia na palach w przypadku infekcji lub gdy poziomy niektórych prozapalnych cytokin są podwyższone. Oczywiście, to tylko spekulacja.

He could ambulate independently but with extreme toe walking - he was unable to walk flat footed when requested. Ankles could neither be actively or passively dorsiflexed to neutral and pain was absent. CK was 1876. One week later, his walking was much improved; some toe walking was noted when he ran, and the heel cords were much looser. Three weeks after onset, his CK and lactate dehydrogenase returned to normal and his gait was normal.

Toe walking is rarely acute, although it has been reported with benign myositis in childhood.^1-3 In one of the original reports, one-third of children with acute myositis walked on their toes.² These authors and others speculate that it was attributed to a forced posture to alleviate pain in the gastrocnemius-soleus complex.^2,3 Our patient continued to have dramatic toe walking for weeks despite the absence of pain. We speculate that toe walking in acute myositis might be due to heel cord or muscle contracture secondary to viral infection and inflammation. Acute toe walking has been reported in a condition that predisposes to infectious processes.⁴ Also, influenza virus has rarely been isolated from the muscle in benign infectious myositis.⁵

McAbee GN Acute toe walking with viral myositis

Benign acute childhood myositis tends to be more prevalent in the late winter and early spring,^1–3 supporting the theory that its underlying cause is viral illness.^2,4,5 As in our patient, most cases in countries of northern latitudes occur in March and April.^1–3

Many viral agents have been linked with benign acute childhood myositis; however, influenza A and B have been most frequently associated with the disease.

Two gait-related abnormalities were reported by Mackay and colleagues⁶ to be characteristic of benign acute childhood myositis: a wide-based, stiff-legged gait and toe-walking. Both abnormalities were present in our patient. This abnormality is due to pain and discomfort in the lower extremities, commonly in the gastrocnemius-soleus muscle group bilaterally.^4,6 Cases have been reported in which other muscle groups were affected (e.g., upper arms), but this finding is relatively rare and invariably associated with symptoms in the lower limbs.⁵ Physical examination generally shows normal strength, tone and deep tendon reflexes in the lower extremities and no neurologic deficits.⁷

Sangeeta Jain, Michael R. Kolber A stiff-legged gait: benign acute childhood myositis

Szczawiany

Musimy szczerze przyznać, że pomimo tego iż na różnych forach i grupach związanych z autyzmem to szczawiany są zazwyczaj obwiniane o to, że powodują chodzenie na palcach to my znaleźliśmy niewiele na ten temat. Taka sugestia została przedłożona przez pana Williama Shawa. Chociaż, zdaje się, że inni badacze nie podjęli tego tematu (z nielicznymi wyjątkami) to jednak jest to warte zgłębienia. Wydaje się, że także tutaj można zaproponować jakąś interwencję[19].

Inne

Z całą pewnością wszystko co zostało wymienione powyżej nie jest kompletną listą przyczyn chodzenia na palcach u dzieci z ASD. Można znaleźć inne, nieopisane w literaturze, a zauważone przez rodziców interwencje które spowodowały ustanie chodzenia na palcach. Przykładem niech będzie chociażby zastosowanie witaminy B6[20].

Our personal experience with high doses of vit B6 began when a blood test showed the children to be seriously deficient. At that point, Misha had verbal and bodily tics (snorting uncontrollably, repeating idiotic phrases endlessly, nose twitches and shoulder jerks). Both boys flapped their hands and walk on the tops of their folded-under toes; when Misha had learned to speak well, he told me his hands felt like needles were in them. This is medically known as "peripheral neuropathy," a feeling of numbness and tingling in extremities, and can be due to lack of any of the soluble B vitamins. Within 48 hours of the first dose of B6, tics, hand-flapping and toe-walking disappeared.

http://come-over.to/FAS/FASDnutrition.htm

Konkluzja

Z całą pewnością nie ma jednej uniwersalnej przyczyny, która tłumaczyłaby chodzenie na palcach u wszystkich dzieci autystycznych. Co więcej, wydaje się, że w przypadku niektórych dzieci takich przyczyn może być więcej niż jedna, biorąc pod uwagę częstość występowania w tej grupie stresu oksydacyjnego, ekscytotoksyczności czy zaburzeń metabolicznych. Część z tych rzeczy da się sprawdzić, a dla niektórych zaproponować skuteczną interwencję. Temat chodzenia na palcach potraktowany jest w literaturze dotyczącej autyzmu (zapewne z uwagi na to, że nie jest osiowe zaburzenie) bardzo pobieżnie. W związku z powyższym niniejszy post nie daje jasnych, jednoznacznych odpowiedzi.

Referencje

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/860890
[2] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7687150
[3] Neurobiological Issues in Autism
[4] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13261
[5] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8513041
[6] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8911222
[7] https://molecularautism.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13229-016-0109-5
[8] http://www.jpeds.com/article/S0022-3476(97)70236-1/abstract
[9] http://www.crstaalm.dds.nl/PCA/PCA2006/2006-1.pdf
[10] https://gene.sfari.org/database/gene-scoring/
[11] https://www.amazon.com/Autism-Oxidative-Stress-Inflammation-Abnormalities/dp/1420068814
[12] https://pl.wikipedia.org/wiki/Selen
[13] https://pl.wikipedia.org/wiki/Kinaza_kreatynowa
[14] http://www.biochemsoctrans.org/content/ppbiost/22/4/386S.full.pdf
[15] https://pl.wikipedia.org/wiki/M%C3%B3zgowe_pora%C5%BCenie_dzieci%C4%99ce
[16] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17028368
[17] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11817520
[18] Cerebral Palsy: Hope Through Research
[19] Oxalates control is a major new factor in autism therapy
[20] http://come-over.to/FAS/FASDnutrition.htm

DLGAP2

Dzisiejszy, krótki post będzie dotyczył genu DLGAP2 (zwanego też czasem SAPAP2). Białko kodowane przez ten gen jest ważnym elementem tzw. zagęszczenia postsynaptycznego (ang. post-synaptic density, PSD). Szacuje się, że na zagęszczenie postsynaptyczne składa się z przynajmniej kilkaset białek[1], a niektóre z nich pełnią funkcję rusztowania. Proszę spojrzeć na poniższy obrazek.

Rusztowanie

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fncel.2014.00058/full

Uważa się, że wiele z białek wymienionych na powyższym obrazku jest zakonserwowanych genetycznie i nie są charakterystyczne jedynie dla naszego gatunku. Co więcej, przypuszcza się, że zamiany dotyczące tych białek skutkują różnymi zaburzeniami neurologicznymi, w tym ASD. Zaburzenia w funkcjonowaniu synaps są postulowane w autyzmie. Uważa się, że takie białka jak PSD-95, białka z rodziny SAPAP oraz SHANK i jeszcze kilka innych tworzą specyficzne rusztowanie, które organizuje obszar postsynaptyczny i służy jako fundament dla receptorów takich jak NMDAR, AMPAR czy mGluR. Na powyższej ilustracji białko DLGAP2 jest oznaczone jako SAPAP (cała rodzina).

As elegant structures designed for neural communication, synapses are the building bricks of our mental functions. Recently, many studies have pointed out that synaptic protein-associated mutations may lead to dysfunctions of social cognition. Dlgap2, which encodes one of the main components of scaffold proteins in postsynaptic density (PSD), has been addressed as a candidate gene in autism spectrum disorders.

https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4113140_2040-2392-5-32-7&req=4

Zaburzenia

O tym w jaki sposób deficyt DLGAP2 może wpływać na zagęszczenie postsynaptyczne mieliśmy okazję wspomnieć przy okazji poprzedniego posta. Pozwolimy sobie ponownie przytoczyć odpowiedni obrazek pokazujący jak wygląda obszar postsynaptyczny u myszek z całkowicie wyłączonym genem DGLAP2. To może nie odpowiadać dokładnie temu co jest widoczne u ludzi z delecją genu DGLGAP2 tylko na jednym chromosomie. Być może w przypadku delecji na jednym chromosomie obserwowana rozbieżność nie jest aż taka wyrazista.

https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4113140_2040-2392-5-32-7&req=4

Okazuje się, że zarówno delecje jak i duplikacje w rejonie prążka 8p23 mogą skutkować poważnymi zaburzeniami. I tak, delecja w tym rejonie łączona jest z upośledzeniem umysłowym, autyzmem, mikrocefalią o problemami kardiologicznymi. Z drugiej strony, duplikacja w tym rejonie także wiąże się z ASD i innymi zachowaniami ze spektrum.

8p23 deletions have been associated with mild mental retardation, cardiac abnormalities, microcephaly, and autism (Giglio et al., 2000; Hutchinson, Wilson,&Voullaire, 1992; Tranebjaerg et al., 1984). A duplication at 8p23.2 that intersected and likely disrupted DLGAP2 has been associated with a male with ASD, repetitive behaviors, and moderate receptive/expressive language delay−discussed by both Marshall in 2008 and, after analysis on a higher-resolution array, reported by Pinto and colleagues (Marshall et al., 2008; Pinto et al., 2010).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28407363

Okazuje się, że zaburzenia w genach z rodziny DLGAP/SAPAP widywane są też u osób ze schizofrenią, Zespołem Tauretta czy OCD.

Notably in the present study, we identified several patient-only variants with enhanced promoter activity, suggesting increased DLGAP2 gene expression may contribute to the pathogenesis of schizophrenia.

Our results indicate that DLGAP2 is a susceptible gene of schizophrenia.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3885712/

For example, serial studies supported that the DLGAP3 gene is a promising functional candidate for Tourette syndrome and obsessive compulsive disorder [9], [10], [11], [12]. Pinto et al. discovered the DLGAP2 gene as a novel gene associated with autism spectrum disorders [13]. Recently, our team has identified a private rare mutation (c.1922A>G) of the DLGAP1 gene, which changes lysine to arginine at codon 641 (K641R) in one out of 121 schizophrenia, but not in 275 non-psychotic control subjects [14].

http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0085373

Model mysi

Badań dotyczących genu DLGAP2 jest, niestety, mniej niż by się chciało. Część z nich dotyczy modelu mysiego. Chyba żadna z publikacji nie opisuje potencjalnych interwencji w przypadku delecji genu DLGAP2. Mimo wszystko przyjrzyjmy się temu jakie zachowanie jest widać u myszek z wyłączonym tym genem. Ponieważ badanie dotyczy myszek to trzeba zachowań należytą ostrożność w interpretacji. Okazuje się, że myszki z wyłączonym genem DLGAP2 były przesadnie impulsywne i reagowały nadaktywnością w kontakcie z czymś nowym (zwłaszcza w pierwszych pięciu minutach).

To assess their basic locomotion ability, we used the open-field test (Figure 1E) and found that Dlgap2 −/− mice demonstrated intact locomotion ability since their performances were quite comparable to the WT mice. However, Dlgap2 −/− mice displayed novelty-induced hyperactivity (Figure 1E) in the first 5 minutes of the test specifically, which was likely due to impulsivity [38].

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113140/

Myszki z wyłączonym genem DLGAP2 były także bardziej agresywne i gorzej się uczyły.

We thus used the resident–intruder task to evaluate the aggressiveness of the Dlgap2 −/− mice. Briefly, mice were single-housed in their home cage for 3 weeks to establish their territory. On the test day, intruders were put in to induce aggressive behaviors in the resident mice. As the results show, Dlgap2 −/− mice displayed an obviously shorter attack latency (Figure 2C). Additionally, the duration and frequency of aggressive behaviors also dramatically increased compared to the WT mice (Figure 2D,E).

We used performance in the water T-maze to determine the repetitive behaviors of Dlgap2 −/− mice. As shown in Figure 3A, there was no significant difference in the number of days to reach the 80% right position criterion between WT and Dlgap2 −/− mice (5.5 and 5.4 days, respectively). All mice reached the criterion on Day 6 and were moved into training session of reversal learning test (Figure 3B). In the learning session of reversal learning test, we found that Dlgap2 −/− mice made a significantly greater number of errors on the first day of learning session in comparison with WT mice (P < 0.05) (Figure 3C). Figure 3D shows the number of errors on each day throughout the 4-day reversal learning session. During reversal learning, both strains improved across days.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113140/

Szpilki dendrytyczne

Okazuje się, że anomalie z zagęszczeniem postsynaptycznym to nie jedynie anomalie widoczne po wyłączeniu genu DLGAP2. Kolejna anomalia dotyczy tzw. szpilek dendrytycznych. To co jest widoczne w przypadku delecji DLGAP2 jest przeciwieństwem tego co jest obserwowane w Zespole łamliwego chromosomu X. Proszę spojrzeć na poniższy obrazek. Widać, że gęstość szpilek dendrytycznych jest niższa u myszek z wyłączonym tym genem w porównaniu ze zdrowymi myszkami.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113140/

The DLGAP2-encoded SAPAP2 specifically interacts with PSD-95/SAP90 and its related proteins through the guanylate kinase domain. The protein is specifically expressed in neuronal cells, and enriched in the post-synaptic density fraction [8], [16], and plays a pivotal role in the molecular organization of synapses and in neuronal cell signaling. In the case of fragile X syndrome, which is a hereditary form of mental retardation caused by functional absence of Fragile X mental retardation protein (FMRP), Schütt et al. reported that mRNA of SAPAP1, 2 and 3 were part of the targets of the FMRP and increased postsynaptic SAPAP2 levels was observed in the hippocampus of FMRP knock-out mice [29], The increased SAPAP2 level may contribute to the aberrant synaptic function in patients with Fragile X syndrome.

http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0085373

Czy w związku z powyższym, interwencje proponowane w Zespole łamliwego chromosomu X okażą się nieskuteczne u osób z delecją genu DLGAP2? Nie jest to przesądzone. W każdym razie istnieją pewne interwencje modulujące morfologię szpilek dendrytycznych.

Substancja biała

Istnieją pewne poszlaki sugerujące, że delecja genu DLGAP2 może wiązać się z nietypowym rozmiarem substancji białej w mózgu. Zdaje się, że nie ma na to bezpośrednich dowodów, ale anomalie związane z substancją białą widoczne są w przypadku niektórych polimorfizmów tego genu.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4552325/

Interwencja

Niestety, wydaje się, że delecja genu DLGAP2 jest bardzo rzadka, w związku z czym nie ma finansowej zachęty do pracy nad lekami. Wydaje się, że z uwagi na podobne anomalie występujące zarówno w delecji DLGAP2 jak i delecji SHANK3, pewne interwencje skuteczne dla SHANK3 mogą być także skuteczne dla DLGAP2. Jak jest naprawdę, na ten moment nikt nie wie na pewno. Były już pierwsze próby kliniczne u pacjentów z delecją SHANK3 (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=Phelan-McDermid&Search=Search) i wspomniano o nich w poprzednim poście. Oprócz wspomnianych tam interwencji być może warto też wspomnieć o podawaniu Rysperydonu, ale w odpowiednio dobranych dawkach.

Another case study examined the effect of risperidone in an 18 year-old woman with PMS. Risperidone was administered daily, and the results showed that 6 mg/day actually worsened behavioral symptoms, including psychomotor agitation, aggression, anxiety, and insomnia, while 1 mg/day of risperidone produced significant improvements using the Clinical Global Impression Improvement Scale [80, 81]. The authors hypothesized that by blocking dopamine 2 receptors, risperidone promotes NMDA transmission and reverses the glutamatergic dysregulation due to loss of SHANK3. Further, the authors argue that the differential effect of high- and low-dose risperidone is consistent with results from animal models, which suggest that risperidone has dose-dependent effects on glutamate receptor subtypes [82].

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4489957/

Konkluzja

Delecje w rejonie prążka 8p23 często skutkują delecją genu DLGAP2. Zebrane dane dotyczące ludzi i badania na modelu zwierzęcym sugerują, że aberacje związane z tym genem mogą mieć znaczący wpływ na funkcjonowanie mózgu i skutkować zaburzeniami ze spektrum autyzmu, schizofrenią, OCD czy Zespołem Tauretta. Wykazano też pewne anomalie związane z zagęszczeniem postsynaptycznym i szpilkami dendrytycznymi. Niestety, na ten moment nie ma w tym przypadku ma zaakceptowanego postępowania medycznego. Istnieją obiecujące próby kliniczne (ale dopiero w pierwszej fazie), które sugerują pewne rozwiązania dla delecji SHANK3. Być może pacjencji z delecją DLGAP2 również pozytywnie zareagują na interwencje stosowane w delecja SHANK3. Czas pokarze (miejmy nadzieję.)

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Postsynaptic_density
[2] https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=PMC4113140_2040-2392-5-32-7&req=4
[3] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28407363
[4] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3885712/
[5] http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0085373
[6] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113140/
[7] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4552325/
[8] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4489957/

Za mała gęstość

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25071926

Na rysunku powyżej widzimy deficyty w zagęszczeniu postsynaptycznym (ang. postsynaptic density, PSD) obserwowane u myszek, którym wyłączono gen DLGAP2 (po lewej obraz dla myszki z grupy kontrolnej, po prawej dla myszki z wyłączonym genem DLGAP2). W porównaniu z osobnikami z grupy kontrolnej zarówno długość jak i gęstość PSD są statystycznie różne. Autorzy badania[1] sugerują, że białko kodowane przez gen DLGAP2 jest składową zakonserwowanej genetycznie struktury neurexin-neuroligin-DLG4-DLGAPs-SHANKs, kluczowej dla prawidłowego funkcjonowania synaps i wpływającej na nasze zachowania. Anomalie związane z zagęszczeniem postsynaptycznym występują także w przypadku delecji w rejonie prążka q13.3 chromosomu 12, w szczególności delecji genu SHANK3. Mutacje związane z genem SHANK3 są wykrywane u osób z ASD[2]. Wspomniana delecja 22q13.3 zwana jest inaczej zespołem Phelan-McDermida[3]. W ramach wspomnianej delecji możemy nie mieć wielu genów, ale wielu naukowców uważa, że kluczowy jest tutaj brak genu SHANK3 (choć, oczywiście, nie ma pełnej zgody w tym temacie).

Jeśli kogoś interesuje temat autyzmu to z pewnością zetknął się z pojęciem równowagi E/I (ang. Excitatory/Inhibitory balance). Sugeruje się, że w przypadku ASD równowaga ta jest zachwiania i przesunięta w kierunku nadmiernej ekscytacji neuronów (wysoki odsetek osób z autyzmem, u których występują napady padaczkowe zdaje się to w pewien sposób potwierdzać). Ponieważ w autyzmie nic nie jest proste to można się spodziewać, że istnieją osoby z zachowaniami ze spektrum u których ta równowaga odchylona jest w stronę nadmiernej inhibicji. Takim przykładem są właśnie osoby z zespołem Phelan-McDermida (w skrócie PMDS lub PMS) . Spójrzmy na poniższy cytat[4]:

Here, we show that neurons derived from iPS cells from PMDS patients have major defects in excitatory synaptic transmission arising from both a failure to form the correct number of excitatory synapses and a reduction in the expression of glutamate receptors. As no significant impairments in inhibitory synaptic transmission were found, this resulted in an imbalance between excitation and inhibition at a cellular level.

https://www.nature.com/nature/journal/v503/n7475/full/nature12618.html

Czy można w jakiś sposób zmienić trajektorię rozwoju osób z zespołem Phelan-McDermida? Okazuje się, że tak (przynajmniej do pewnego stopnia u niektórych osób). Przyjrzyjmy się nad czym tutaj pracują badacze.

Donosowa insulina

Z pośród interwencji które były testowane przez badaczy w zespole Phelan-McDermida na dwie chcielibyśmy zwrócić uwagę. Pierwszą z nich jest donosowa insulina. Postaramy się zwięźle przedstawić rezultaty pewnej próby klinicznej (randomizowanej, podwójnie ślepej)[5]. Pierwszą rzeczą, na którą warto zwrócić uwagę są oczywiście potencjalne skutki uboczne. Pomimo tego, że badacze obserwowali podrażnienie śluzówki nosa a nawet krwawienie to te dokuczliwości występowały jedynie w pierwszych dniach interwencji. Ponieważ te łagodne skutki uboczne występowały zarówno w grupie otrzymującej placebo jak i insulinę to badacze skonstatowali, że u osób, które uczestniczyły w badaniu nie było widać efektów ubocznych, które można byłoby przypisać jedynie insulinie.

No SAEs or suspected serious adverse reactions have been reported. Expected adverse events such as nosebleeds and irritation of the nasal area were frequently reported (12 of 25 children). These were limited to 1 or 2 days and usually occurred only once per period in both placebo and insulin groups. Most other adverse events reported, like upper airway infections and gastro-enteritis, are common in children and occurred in both placebo and insulin groups.

http://www.nature.com/ejhg/journal/v24/n12/full/ejhg2016109a.html

Co ciekawe autorzy nie zadawali sobie nawet trudu oznaczania poziomu glukozy we krwi, zdając sobie sprawę, że taki sposób aplikowania insuliny nie ma na to wpływu.

Several independent studies have shown that intranasal insulin administration did not alter systemic insulin concentration or glucose levels in children and adults.^13,15,18 Therefore, peripheral glucose or insulin levels were not measured in study participants.

http://www.nature.com/ejhg/journal/v24/n12/full/ejhg2016109a.html

Co badaczom udało się ustalić? Zanim odpowiemy na to pytanie to warto krótko wspomnieć o trajektorii rozwoju dzieci z zespołem Phelan-McDermida. Okazuje się, że o ile rozwój dzieci z tym zespołem początkowo ma miejsce (ale i tak jest wolniejszy niż u zdrowych rówieśników) to w okolicach trzeciego roku następuje stagnacja lub wręcz regres. Wspominamy o tym dlatego, że o ile nie udało się stwierdzić poprawy w funkcjonowaniu w całej grupie o tyle w podgrupie dzieci starszych niż 3 lata już tak.

In a recent study, we showed less favourable developmental growth in PMS patients after the age of 3 years, with a slow but steady increase in developmental abilities up to that age that is followed by decreased or stagnated developmental growth after.³

First of all, our initial power analysis assumed that children with PMS would develop at a rate of 28% of typical development (1.7 months per 6 months) based on data from four children with PMS.¹⁶ However, as we recently showed in a study of 34 children, development in PMS is not a linear process and development stagnates after the age of 3 years.³

In the pre-treatment period, the mean change in DAE ranged from 0.4 to 1.8 months per 6 months for the five domains of general development (Bayley-III-NL).

It increased the level of developmental functioning by 0.4–1.4 months per 6-month period, but the effect was not statistically significant in this small group.

Our study shows a positive observed effect of intranasal insulin on psychomotor and behavioural development. However, this effect of intranasal insulin was not strong enough to reach statistical significance in our small group of patients, but some statistically significant positive effects were seen in the subgroup of children older than 3 years of age.

http://www.nature.com/ejhg/journal/v24/n12/full/ejhg2016109a.html

Zwróćmy proszę uwagę, że rozwój dzieci z zespołem Phelan-McDermida daleki jest o wzorcowego. Na każde 6 miesięcy dziecko z tym zespołem "idzie do przodu" o jedyne 0.4 - 1.8 miesiąca. Dodanie do tego dodatkowego 0.4 – 1.4 miesiąca robi różnicę (przynajmniej dla dzieci starszych). Najlepiej będzie jeśli przytoczymy konkluzję autorów badania (pogrubienie moje), która mówi, że donosowa insulina stanowi bezpieczną i łatwą interwencję w PMS.

In conclusion, the application of intranasal insulin is a non-invasive, safe, easy and interesting therapeutic approach to improve intellectual and behavioural development in children with PMS. Our preliminary results show that it increased the level of developmental functioning, especially in children older than 3 years, who usually show a stagnation of development.

Thus, younger children might benefit less from intranasal insulin to reach their maximal capacity for development, whereas older children who do not develop at their maximal capacity could benefit more. Further studies are needed to support this observation.

http://www.nature.com/ejhg/journal/v24/n12/full/ejhg2016109a.html

IGF-1, czyli Insulin-like growth factor 1

Kolejną interwencją, o której w naszym przekonaniu warto wspomnieć w kontekście zespołu Phelan-McDermida jest IGF-1. W randomizowanej próbie klinicznej brało udział zaledwie 9 osób, ale jej głównym celem była ocena bezpieczeństwa. I chociaż efekty uboczne występujące u osób otrzymujących IGF-1 były bardziej nasilone niż w grupie otrzymującej placebo to jednak były tego samego rodzaju.

Because this was a small pilot trial, our primary focus was on safety. IGF-1 was generally well tolerated and there were no serious adverse events (SAEs) (see Table 2). The most common side effects during the IGF-1 treatment phase were sleep disturbance (N= 7); hypoglycemia ((<50 mg/dL) (7 occurrences; N= 5)), constipation (N= 4), increased appetite (N= 4), and mood changes or increased irritability (N = 4). Other less common AEs ‘possibly’ or ‘probably related’ to IGF-1 and worth noting included decreased appetite (N= 2), increased urinary frequency (N = 1), hair loss (N= 1), rash (N = 1), and soft tissue swelling of the nose (N = 1).

Many of the same AEs were likely to occur among patients during the placebo phase, including hypoglycemia (3 occurrences; N= 2), albeit less frequently; significantly more AEs were reported when patients were taking IGF-1 than placebo (P = 0.0015).

In addition, we showed that when patients received IGF-1 they were significantly more likely to report AEs and this may have introduced bias and contributed to the caregivers’ anticipation of benefit.

Further, while patients were more likely to report AEs while on IGF-1, the nature of AEs was similar between treatment groups.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4326443/

Jeśli chodzi o rezultaty to najlepiej będzie jak wkleimy obrazki prezentujące zmiany w zachowaniach społecznych i rytualnych dla grup otrzymujących IGF-1 i placebo. Są one statystycznie istotne (różnica w bazowym poziomie jest jak najbardziej dopuszczalna przy tak mało licznej grupie).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4326443/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4326443/

Przyjrzyjmy się przez chwilkę dlaczego taka interwencja jest w stanie potencjalnie zadziałać. W tym celu posłużymy się badaniem przeprowadzonym na myszkach[4]. Jak już zostało to wcześniej wspomniane, akurat w przypadku zespołu Phelan-McDermida obserwowany jest brak równowagi E/I.

To gain insight into the mechanism underlying the impairment of excitatory synaptic transmission in PMDS neurons, we measured the expression levels of AMPA and NMDA receptors. PMDS neurons expressed significantly less GLUA1 and GLUN1 proteins (Fig. 3a) and generated significantly smaller currents in response to the focal application of either AMPA (Fig. 3b) or NMDA (Fig. 3c). In contrast, the amplitude of c-aminobutyric-acid-evoked currents was similar for both control and PMDS neurons (Supplementary Fig. 9), indicating that PMDS neurons express a decreased number of excitatory neurotransmitter receptors and normal levels of inhibitory receptors.

https://www.nature.com/nature/journal/v503/n7475/full/nature12618.html

Kolejnym krokiem była próba przeprowadzenia testu z różnymi substancjami, które mogą wpłynąć na ekspresję genu SHANK3. Jakież było zdziwienie badaczy kiedy okazało się, że IGF-1 normalizuje pracę synaps (zwiększając ilość receptorów NMDA i AMPA) pomimo tego, że obniża ekspresję genu SHANK3.

We next tested if we could restore synaptic deficits in PMDS neurons pharmacologically, using agents that have been previously reported to increase the level of SHANK3 expression or to increase synaptic transmission, including trichostatin A (TSA)^17,18, valproic acid (VPA)^17,19, nifedipine (Nif)²⁰, IGF1^21–23 and IGF2²⁴.

To gain insight into the mechanism of IGF1 action, we measured SHANK3 expression in control and PMDS neurons treated with IGF1. Surprisingly, we found that IGF1 caused a marked decrease of SHANK3 protein expression in the cell body and processes of both control and PMDS neurons (Supplementary Fig. 15).

Finally, IGF1 completely restored the whole-cell NMDA receptor currents evoked by focal application of NMDA, but failed to fully restore whole-cell AMPA receptor currents elicited by application of AMPA (Supplementary Fig. 14). Together, these results indicate that treatment with IGF1 restores synaptic transmission in PMDS neurons by increasing the number of synaptic AMPA and NMDA receptors.

https://www.nature.com/nature/journal/v503/n7475/full/nature12618.html

Okazuje się, że neurony można pogrupować pod względem tego czy zawierają białko kodowane przez gen SHANK3 czy nie. IGF-1 wspiera powstawanie tych drugich (posiadających PSD95 bez SHANK3).

This indicates that in developing neurons there are three populations of excitatory synapses: those that contain SHANK3 alone, those that contain SHANK3 and PSD95, and those that contain PSD95 alone.

We also demonstrated that SHANK3 and IGF1 largely restore synaptic deficits in PMDS neurons. Interestingly, IGF1 decreases SHANK3 expression and promotes the formation of a class of synapses containing PSD95 but lacking SHANK3. One possibility is that SHANK3 is required at an early stage of synapse formation, and that IGF1 promotes maturation of synapses by triggering the loss of SHANK3 and recruitment of PSD95. Consistent with this view, SHANK3-containing synapses have slowly decaying NMDA receptor currents that resemble those of GLUN2B receptors that occur early in development, whereas synapses that contain PSD95 but lack SHANK3 have rapidly decaying NMDA receptor currents that resemble the GLUN2A-containing synapses that appear later in development²⁸.

https://www.nature.com/nature/journal/v503/n7475/full/nature12618.html

I na koniec jeszcze ostatnie słowo od autorów.

In summary, we have identified synaptic defects in iPS cell-derived neurons from patients with PMDS and we show that these defects depend on loss of SHANK3 and can be reversed by IGF1.

https://www.nature.com/nature/journal/v503/n7475/full/nature12618.html

Wracamy na Ziemię.

PAK1 inhibitor, no nie wiem

W poszukiwaniu czegoś co mogłoby pomóc osobom z zespołem Phelan-McDermida przewertowaliśmy stronę Petera. Warto to robić ponieważ ma on ciekawe, często mało oczywiste pomysły. W poście o inhibitorach PAK1 sugeruje on, że mogą być pomocne w omawianym zaburzeniu[7]. Ponieważ zespół Phelan-McDermida mnie żywotnie interesuje oraz jednym z dostępnych inhibitorów PAK jest BIO30 Propolis to temat jest wart poświęcenia mu uwagi. Co jest dziwnego, dokładnie ten sam fragment z publikacji[8], którą przytacza Peter w kontekście skuteczności inhibitorów PAK1 w zespole Phelan-McDermida my chcemy przytoczyć by pokazać, że jest wprost przeciwnie. Chodzi o poniższy fragment.

Consistently, we have found that Shank3 knockdown leads to reduced PAK1 activity. Moreover, inhibiting PAK1 decreases the basal NMDAR current, and the reducing effect of Shank3 knockdown on NMDARs and F-actin is occluded by PAK1 inhibitors and blocked by constitutively active PAK1.

http://www.jneurosci.org/content/33/40/15767

Dlaczego uważamy, że inhibicja PAK1 może nie być zbyt dobrym pomysłem? Proszę spojrzeć.

In neurons with the loss of Shank3, the reduced Rac1 and PAK activity results in the increased cofilin activity (due to reduced cofilin phosphorylation). Consequently, actin depolymerization is increased, leading to disrupted NMDAR membrane delivery through the actin cytoskeleton.

In the current study, we examined whether the NMDAR hypofunction and ASD-like behavioral deficits in autism models with Shank3 haploinsufficiency is caused by the decreased Rac1/PAK signaling and increased actin depolymerization by cofilin, and whether manipulating actin regulators could rescue the synaptic and cognitive deficiencies in this autism model.

Concomitantly, Shank3-deficient mice have a marked loss of cortical actin filaments, which is associated with the reduced Rac1/PAK activity and increased activity of cofilin, the major actin depolymerizing factor. The social deficits and NMDAR hypofunction are rescued by inhibiting cofilin or activating Rac1 in Shank3-deficient mice, and are induced by inhibiting PAK or Rac1 in wild-type mice.

Taken together, these results suggest that the ASD-like behavioral and physiological deficits can be induced by Rac1 inhibition in normal animals, and can be rescued by Rac1 activation in Shank3-deficient conditions.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4464902/

Jeśli dobrze rozumiemy powyższe to w przypadku myszek z wyłączonym genem SHANK3 pewne deficyty mogą zostać skorygowane poprzez aktywację Rac1 (i w konsekwencji aktywację PAK). Co więcej w mysim modelu SHANK3 obserwuje się już niską aktywność PAK. Idea polegająca na dalszym obniżaniu aktywności PAK1 może nie być wcale taka nieracjonalna (warto spojrzeć chociażby kilka akapitów wyżej na wpływ IGF-1 na SHANK3) ale nie wiem czy jest poparta publikacjami. Może mniejsza.

O pewnym cukrze połączonym z magnezem

Nie wiemy, czy jest to interwencja, którą warto rozważyć przy zespole Phelan-McDermin. Być może. Okazuje się, że kombinacja magnezu i pewnego cukru (ang. threonate - jak to przetłumaczyć?) zwiększa gęstość synaptyczną. Nie zadzieje się tak ani pod wpływem podawania samego magnezu, ani samego cukru.

Threonate is a critical component of L-TAMS; when animals are treated with Mg2+ that is not coupled to threonate (ie. an alternate anion such as chloride is used), there is no significant effect on memory ability (Slutsky et al., 2010). However, threonate treatment alone, without Mg2+, also does not affect memory ability, suggesting that there is a synergistic effect between threonate and Mg2+ (Slutsky et al., 2010).

Our previous work showed that threonate also has effects in the central nervous system (CNS). Oral treatment with the combination of threonate and magnesium (Mg2+) in the form of L-threonic acid Magnesium salt (L-TAMS) increases synapse density and memory ability in both aged rats and late stage Alzheimer’s disease (AD) model mice (Li et al., 2014; Slutsky et al., 2010). A recent study shows that L-TAMS is also effective at improving cognitive deficits in humans (Liu et al., 2015).

NR2B-containing NMDAR plays an important role in controlling synaptic plasticity (Le Roux et al., 2007). Upregulation of its expression is sufficient to enhance learning and memory ability (Tang et al., 1999). Elevation of extracellular [Mg2+] can selectively increase synaptic NR2B-containing NMDAR (Slutsky et al., 2004, 2010). We checked whether threonate treatment can also affect NR2B. Threonate treatment significantly upregulated NR2B containing NMDAR in hippocampal neurons (F3,17 ¼ 7.493, p ¼ 0.0021; Fig. 4A).

Threonate treatment directly elevated expression of synaptic NR2B.

Similar to our findings in cultured rat hippocampal neurons, threonate treatment significantly increased Syn and PSD-95 expression in a dose-dependent manner (Syn, F4,67 ¼ 4.499, p ¼ 0.0028; PSD-95, F4,44 ¼ 4.221, p ¼ 0.0056; Fig. 8B, C).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178134

W publikacji testującej L-TAMS[10] pojawia się nawet ciekawa sugestia na temat insuliny.

Insulin promotes Mg2+ influx into the cell, significantly reducing extracellular Mg2+. For example, plasma Mg2+ levels initially decrease significantly following an insulin injection, but can be prevented when insulin is injected with Mg2+ supplementation, such as from a meal (Paolisso et al., 1986). Since the amount of total extracellular brain Mg2+ is low (Ramadan et al., 1989), threonate treatment without concurrent Mg2+ treatment, like with insulin treatment, could quickly reduce CSF Mg2+, resulting in a reduction of the driving force for all Mg2+ channels, limiting the amount of Mg2+ influx that threonate can promote. This might explain why threonate treatment alone does not work in vivo, whereas in culture, where the extracellular [Mg2+] is essentially clamped, threonate treatment effectively increases intracellular [Mg2+].

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178134

Biorąc pod uwagę korzystny profil bezpieczeństwa MMFS-01[11], być może jakiś lekarz może rozważyć i uznać za zasadne spróbowanie użycia MMFS-01 u osób z zespołem Phelan-McDermida.

Dosage was set to correspond to approximately 25 mg/kg/day. To accomplish this, subjects between 50 and 70 kg took 1.5 g/day, and subjects between 70 and 100 kg took 2 g/day of MMFS-01.

The safety population was composed of 25 subjects in the MMFS-01 group and 26 subjects in the placebo group. A total of 47 adverse events were observed among 28 of the 51 subjects in the safety population, experienced approximately equally among subjects in placebo and MMFS-01 groups (15 and 13 subjects, respectively; Table 5). Individual events were considerably more prevalent in the placebo group than in the MMFS-01 group (30 and 17 events, respectively). Most adverse events were mild, and no serious adverse events were observed during the course of the study. No significant changes in body weight, systolic blood pressure, diastolic blood pressure, or heart rate were observed.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178134

Konkluzja

Zespół Phelan-McDermida to poważane zaburzenie. W chwili obecnej nie ma zaakceptowanego leku na to zaburzenie. Całe szczęście coś się tutaj dzieje i pojawiają się próby kliniczne. Co więcej, próby te są zachęcające (chociaż ich celem jest na razie sprawdzanie bezpieczeństwa). Być może korzystny profil bezpieczeństwa i skuteczność w działaniu niektórych testowanych substancji sprawi, że wejdą w przyszłości do powszechnego użycia w zespole Phellan-McDermida.

EDIT: Podziękowania za Rafała za podpowiedź, że threonate tłumaczone jest na polski jako treonian.


[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25071926
[2] https://sfari.org/funding/grants/abstracts/the-role-of-shank3-in-autism-spectrum-disorders
[3] https://pl.wikipedia.org/wiki/Zespół_delecji_22q13.3
[4] https://www.nature.com/nature/journal/v503/n7475/full/nature12618.html
[5] http://www.nature.com/ejhg/journal/v24/n12/full/ejhg2016109a.html
[6] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4326443/
[7] https://epiphanyasd.blogspot.com/2014/05/pak-inhibitors-not-just-for-cancer.html
[8] http://www.jneurosci.org/content/33/40/15767
[9] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4464902/
[10] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178134
[11] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4927823/

Delecje

http://agdziedrugijez.pl/hg19/cytobands/cytobands.html

Na rysunku powyżej widać fragment programu do wyszukiwania dużych delecji w wynikach z 23andMe. Wyniki z 23andMe nie są stworzone do tego aby szukać w nich delecji. Jeśli szukasz dużych delecji (~100 tyś. bp) to dobrym sposobem wydają się mikromacierze, jeśli szukasz krótkich delecji (~100 bp) to badania WES/WGS będą pomocne. Do wyniku wyszukiwania dużych delecji w wynikach z 23andMe należy podchodzić ostrożnie. Wyszukiwanie opiera się na kilku założeniach. Po pierwsze zakładam, że delecja na dwóch bliźniaczych chromosomach skutkuje wartością '--' w wyniku. Taka wartość może się też pojawić, niestety z innych powodów. Druga sprawa to taka, że w dużym fragmencie kolejnych wariantów z wartością '--' nie dopuszczam innych wartości, żeby uznać dany fragment za delecję. Takie pojedyncze warianty z innymi oznaczeniami mogłyby się pojawić za sprawą homologów/ortologów/paralogów czy pseudogenów. Jeśli tak będzie to taki fragment nie zostanie uznany za delecję (być może przydałoby się wprowadzić do programu pewną tolerancję na tego typu rzeczy). O ile delecja na parze chromosomów wydaje się, że skutkuje oznaczeniem '--' (w wynikach są też oznaczenia 'DD' oznaczające delecje, ale nie o takie delecje chodzi) to delecja na pojedynczym chromosomie jest bardziej problematyczna. Prawdopodobnie skutkuje ona tym, że pewien spory fragment kolejnych wyników dla wariantów składa się wyłącznie z genotypów o dwóch takich samych allelach. Ta sytuacja wcale nie musi być patologiczna i nie musi oznaczać delecji. Żeby błędnie nie zakwalifikować takiego czegoś jako delecji należało ustawić duże wartości w parametrach dla wykrywania delecji na pojedynczym chromosomie.

Obsługa programu jest bardzo prosta. Po naciśnięciu przycisku "przeglądaj" wybiera się plik z surowymi danymi. Program rozpoczyna pracę automatycznie najpierw pobierając plik, następnie go odczytując. W kolejnej fazie zaznacza na obrazku z chromosomami odpowiednie obszary, które podlegały genotypowaniu, na podstawie wczytanego pliku. W tym samym czasie próbuje wykryć delecje i jeśli tak się stanie rysuje odpowiednie informacje i dodaje info o tym co zostało znalezione (na spodzie strony). Oznaczone w wyniku warianty rysowane są kolorem zielonym, znalezione delecje na obu chromosomach kolorem czerwonym a na jednym chromosomie kolorem pomarańczowym. Można zmienić parametry wyszukiwania i/lub skalę obrazka i nacisnąć przycisk rysuj. Wykres zostanie ponownie narysowany dla zmienionych danych.

Jakie delecje można wykryć

Wykrycie delecji zależy od gęstości wariantów w danym zakresie i od ustawień programu. Jeśli ustawimy, że interesują nas duże delecje to jeśli program coś wykryje to jest większa szansa, że to co zrobił jest poprawne. Jeśli zmniejszymy parametry programu tak, żeby wykrywać mniejsze delecje to program stanie się bardziej "czuły", ale zaczynają wkradać się nieprawidłowości (wyniki fałszywie pozytywne). Poniżej przedstawionych zostało kilka przykładów wyszukiwania delecji w (spreparowanych) wynikach z 23andMe. Przykłady zostały przygotowane na podstawie dostępnej literatury medycznej opisującej wykryte delecje.

Delecja 22q11

Na rysunku obok widzimy delecję na 22 chromosomie w okolicach locus q12. Obrazek przedstawie delecje dla trzech różnych pacjentów powiększone w programie do wielkości x8. Kolorem czerwonym zaznaczono co prezentowałby program gdyby delecja dotyczyła obu chromosomów, kolorem pomarańczowym gdyby delecja dotyczyła tylko jednego chromosomu. Delecja tego regionu występuje z częstotliwością 1/4000 i skutkuje opóźnieniem rozwoju, opóźnieniem mowy, problemami z nauką, zachowaniami ze spektrum autyzmu i ADHD. Czasami symptomy mogą być na tyle łagodne, że opóźniają właściwą diagnozę.

Delecja 22q13

Delecja 22q13.3 nosi też nazwę zespołu Phelan-McDermida. Częstotliwość występowania nie jest znana, ale podejrzewa się, że jest bardzo niska. W rejonie 22q13 występuje gen SHANK3, silnie powiązany z autyzmem. Dlatego też delecje w rejonie 22q13 skutkują objawami ze spektrum autyzmu. Na rysunku obok widać rzeczywistych 5 przypadków delecji w tym rejonie zaczerpniętych z literatury. To co się rzuca w oczy to to, że rozmiary tych delecji są radykalnie różne. W przypadku drugiego pacjenta widać, że doszło do delecji całego locus q13.31, podczas gdy u trzeciego pacjenta widać, że brakuje tylko krótkiego fragmentu w locus q13.33. Co więcej, ta delecja nie zostanie znaleziona przez opisywany program na standardowych ustawieniach, trzeba zmniejszyć do 10 ilość kolejnych wariantów z '--' w parametryzacji.

Delecja 1p36

Po lewej widzimy delecję na pierwszym chromosomie. Występuje z częstotliwością około 1/5000. Osoby z tą delecją dotknięte są często różnymi dymorfizmami. Ich rozwój umysłowy jest także nieprawidłowy.

Konkluzja

Wiele osób wykonuje badania w 23andMe. Nie są to drogie badania, ale nie niosą tyle informacji co np.: WES czy NGS. Wydaje się, że dziecko dotknięte różnymi dymorfizmami, cierpiące na padaczkę czy z ciężkim upośledzeniem umysłowym powinno mieć pogłębioną diagnostykę genetyczną. W praktyce okazuje się, że badania kariotypu czy MLPA niczego nie wykrywają a z uwagi na to, że za mikromacierze czy WES muszą zapłacić rodzice to badania te nie są wykonywane. Opisywany tutaj program stara się wykryć duże delecje w wynikach z 23andMe. Oczywiście, wszystkiego co wykryje ten program nie należy brać za "dobrą" monetę i trzeba potwierdzić znalezisko w odpowiednim badaniu genetycznym (mikromacierze, WES). Być może istnieją osoby, które nie zdecydowały się na mikromacierze czy WES a wykonały badanie w 23andMe i może są rzeczywiście posiadaczami jakiejś dużej delecji. Opisywane na tej stronie przykłady kilku delecji nie wyczerpują możliwości opisywanego programu. Stanowią jedynie przykład. Jeśli ktoś ma ochotę to zapraszam do korzystania z programu. Należy się wyczulić na to, że program prawdopodobnie pokaże problem w rejonie chromosomów X i/lub Y. Dla kobiet będzie zgłaszał błąd, że nie ma dużej ilości danych na chromosomie Y (hmmm, właściwie całego chromosomu). W przypadku chromosomu X wydaje się, że 23andMe ma jakiś problem z genotypowaniem i czasem brakuje dużych fragmentów tego genu. Nie sądzę, że tak jest w rzeczywistości, raczej to błąd po stronie 23andMe. Wydaje się, że można spokojnie zignorować wskazywane delecje na chromosomie X i Y.

Program znajduje się pod adresem: http://agdziedrugijez.pl/hg19/cytobands/cytobands.html

Kanały sodowe i klonazepam

Profesor William Albert Catterall

Profesor William Albert Catterall to światowej klasy ekspert w zakresie budowy i funkcjonowania kanałów jonowych. Co mnie niepomiernie cieszy to to, że ostatnimi czasy jego dociekania dotyczą także autyzmu. Dzisiejszy, krótki post będzie dotyczył głównie jego publikacji "Autistic behavior in Scn1a+/− mice and rescue by enhanced GABAergic transmission[1]". Jak mogliśmy się przekonać z poprzednich postów dotyczących kanałów sodowych różne defekty różnych kanałów sodowych rodzą różne konsekwencje. Nic nie jest tu proste i oczywiste. Wydaje się, że jednym z kryteriów podziału tych defektów może być ocena w jakim stopniu dany defekt wpływa na pracę kanału, czy konsekwencją defektu jest nadmierna przepuszczalność kanału czy też wprost przeciwnie, ograniczona przepuszczalność. Żadna z tych skrajności nie jest pożądana. Wydaje się, że nadmierna przepuszczalność kanału skutkuje raczej padaczką, podczas gdy ograniczona przepuszczalność powoduje raczej autyzm. Co ciekawe, u niektórych osób z defektem skutkującym brakiem działania kanału sodowego (i widocznym autyzmem) występuje też padaczka. To może sugerować, że podział ze względu na nadmierną/ograniczoną przepuszczalność nie jest do końca precyzyjny. Pewne wskazówki widać z prac badaczy nad Zespołem Draveta. Zespół Draveta spowodowany jest przez mutacje w genie SCN1A, które skutkują tym, że kanały sodowe Nav1.1 przestają przepuszczać jony. Brak funkcjonowania kanałów sodowych pozostaje w sprzeczności z obserwowaną u pacjentów padaczką. Wydaje się, że to nadmierna przepuszczalność kanału (a nie jej brak) powinna skutkować padaczką. Sprawy są trochę bardziej skomplikowane.

One current research project focuses on severe myoclonic epilepsy of infancy, an autosomal dominant genetic epileptic encephalopathy with devastating consequences for affected children, which is caused by heterozygous loss-of-function mutations in the gene encoding the brain sodium channel Nav1.1. He has developed a mouse genetic model that recapitulates all of the features of this disease, including the pattern and severity of seizures and the co-morbidities. With this mouse model, he has shown that the primary pathogenic event in this disease is failure of action potential generation in GABAergic inhibitory neurons. This impairment disinhibits the excitatory neurons and causes uncontrolled hyperexcitability and epilepsy, as well as ataxia, sleep disturbance and other co-morbidities.

Sodium channels are critical regulators of neuronal excitability. De novo loss of function mutations in the SCN1A potentially lead to haploinsufficiency of Nav1.1 channels. Theoretically, haploinsufficiency of the Nav1.1 channel should not cause epilepsy because reduced sodium current produces neuronal inexcitability rather than hyperexcitability that is associated with seizure activity.

Dr. Catterall has generated mouse models of Dravet Syndrome by ablating the SCN1A gene in mice and has shown that dramatic loss of sodium current in the hippocampal GABAergic inhibitory neurons in these mice may cause their epilepsy.

The results of these mouse models suggest that failure of excitability of hippocampal GABAergic inhibitory neurons is a possible cause of this intractable epilepsy syndrome.

Dr. Catterall found that mice with a heterozygous loss of one allele of the Nav1.1 channel gene are ataxic, as measured in tests of walking a straight line and walking on a narrow rod. Analysis of the cerebellar Purkinje neurons, which are crucial in coordinating movement, show that there is a dramatic loss of sodium current. Loss of excitability of these neurons is sufficient to cause profound ataxia.

The Purkinje neurons are unique because they are GABAergic inhibitory neurons that serve as projection neurons, in contrast to virtually all other projection neurons, which are excitatory. Dr. Catterall’s team believes that the dramatic loss of sodium current in both the hippocampal inhibitory GABAergic interneurons and the cerebellar inhibitory Purkinje neurons means that many classes of GABAergic neurons throughout the brain may have reduced sodium currents and reduced excitability, and that impaired excitability of these other inhibitory neurons may be responsible for other aspects of the disease like spasticity and cognitive impairment.

http://www.ice-epilepsy.org/the-sodium-channel-and-morbidities-associated-with-dravet-syndrome.html

Z powyższych cytatów wyłania się następujący obraz. Utrata funkcji przez kanały sodowe powoduje, że trudniej je wzbudzić. To sugeruje, że padaczka nie powinna występować. Ponieważ kanały sodowe (w tym przypadku Nav1.1) występują także w hipokampie to neurony, które tam występują również trudniej wzbudzić. Ale GABAminergiczne neurony, które tam występują mają za zadanie wyhamowywać nadmierną ekscytację innych neuronów. Ich utrudnione wzburzenie skutkuje tym, że nie mogą prawidłowo wykonywać swojej pracy (m.in. wyhamowywać nadmiernej ekscytacji innych neuronów) i pojawia się padaczka.

Modelowanie autyzmu u myszek

Rozpoznawanie emocji u myszek

Na ilustracji po lewej stronie widzimy praktyczny przewodnik po tym jak rozpoznawać emocje u myszek. To, oczywiście, słaby żart, ale obrazuje z jakimi trudnościami borykają się badacze chcący ocenić czy dana mysz jest autystyczna i czy testowana ingerencja sprawia, że autystyczna przestaje być. Biorąc pod uwagę, że ocena czy ktoś jest autystyczny czy nie jest trudna w przypadku ludzi to co dopiero w przypadku myszek. Żeby przezwyciężyć wiele trudności badacze starają się opracowywać różne testy, które pozwalają odróżnić autystyczną mysz od takiej, która autyzmu nie ma. Dlaczego o tym tutaj piszę? Ano, niestety, badania profesora Catteralla dotyczą na razie gryzoni, a nie ludzi, więc jednak wypada coś na temat autyzmu u mysz powiedzieć. Pomijając fakt w jaki sposób badacze próbują wywołać autyzm u myszy przyjrzyjmy się pobieżnie w jaki sposób badacze sprawdzają czy rzeczywiście mysz jest autystyczna (albo przynajmniej, znacząco inna od normalnej). O tym poniżej.

Test otwartej przestrzeni

Nagrania z kamery rejestrującej
eksplorację terenu myszki zdrowej
i z tej z autyzmem

Jednym z osiowych zaburzeń w ASD jest sztywny schemat zachowań, wąski zakres wyuczonych zachowań, obawa przed nowością. W przypadku lepiej funkcjonujących osób z ASD często występuje niepokój, trwoga, bojaźliwość (ang. anxiety). Jednym z testów, który stara się badać nasilenie takich zachowań u gryzoni jest test otwartej przestrzeni (ang. open field test). Testowana mysz jest umieszczana w zamkniętym pojemniku nad którym znajduje się kamera. Normalna mysz spędza początkowo bardzo dużo czasu przy ściankach pomieszczenia bojąc się wyjść na otwartą przestrzeń z obawy przed czyhającym niebezpieczeństwem (które, w istocie, może jej grozić w warunkach naturalnych). Z biegiem czasu myszka nabiera pewności siebie, pokonuje wrodzoną bojaźliwość i eksploruje całą dostępną przestrzeń. Okazuje się, że autystyczna mysz przejawia inny schemat zachowań. Przebywa praktycznie cały czas w tym samym miejscu i w całym okresie badania nie eksploruje dostępnej przestrzeni. Oprócz tego, że autystyczna mysz nie przemieszcza się w sposób typowy dla gatunku to widać też inne nieprawidłowe zachowania: autystyczna mysz rzadko zatrzymuje się i obwąchuje otoczenie. Czy takie zachowanie myszki dobrze modeluje niektóre aspekty zachowań u dzieci z ASD? A może autystyczne myszy nie muszą się zachowywać dokładnie tak samo jak ludzie. Przyjrzyjmy się krótko jeszcze innym testom.

Test trzech komór

Celem testu przedstawionego na powyższym obrazku jest ocenia defektów społecznych u autystycznych myszek. Myszki są z natury bardzo społeczne i chętnie zaznajamiają się nowymi, nieznanymi im wcześniej myszkami. W eksperymencie z trzema komorami badaną mysz umieszcza się w środkowej komorze. W jednej z pozostałych komór znajduje się nieznana mysz, a ostatnia komora jest pusta. Jak się łatwo domyślić w przypadku typowej myszki dość szybko dochodzi do interakcji pomiędzy myszkami i badana mysz spędza dużo czasu w komorze, w której znajduje się nieznana jej mysz. Autystyczna mysz zachowuje się zgoła inaczej. Pierwszy kontakt z nieznaną myszką zachodzi nawet czterokrotnie później i czas spędzony z nową myszką jest o połowę mniejszy. Rozszerzeniem tego testu jest umieszczenie dwóch myszek w skrajnych komorach. Jedna z myszek jest znana testowanej myszce, a druga nie. Normalne myszki lubią nowości i więcej czasu spędzają z nieznaną im dotąd myszką. Autystyczna myszka zachowuje się inaczej.

Pozostałe testy

Testów, w których widać, że myszki u których wywołano autyzm zachowują się inaczej niż typowe myszki jest więcej. W przypadku niektórych testów łatwiej widać jak danych test może się przekładać na ludzkie zachowania, w przypadku innych testów jest to trochę trudniej dostrzegalne. Z pozostałych testów warto wymienić obserwacje tego jak myszka często się czyści (te autystyczne robią to znacząco częściej - być może odpowiada to rytualnym, schematycznym zachowaniom widocznym u ludzi z ASD) i test wymuszonego pływania (oceniająca czy myszka cierpi na depresję). Uniesiony labirynt w kształcie znaku plus w założeniu bada bojaźliwość u myszek (otwarte ramiona bez zabezpieczeń wydają się niebezpieczne). Jak to wygląda można zobaczyć na youtube. To co będziemy obserwować o gryzoni zależy też trochę od danej dysfunkcji, która spowodowała, że myszka jest autystyczna. W przypadku braku działania kanału Nav1.1 i zespołu Draveta obserwuje się ataksję. W związku z powyższym wydaje się, że naturalnym celem obserwacji wydaje się sprawdzenia czy myszka potrafi chodzić w linii prostej, czy też nie (być może właśnie z powodu ataksji).

Klonazepam

Klonazepam jest lekiem z grupy benzodiazepin, wykazującym silne działanie przeciwdrgawkowe. Między innymi z uwagi na to, że autyzm często występuje razem z padaczką ten lek jest stosowany także w przypadku osób autystycznych. Z uwagi na działanie uspokajające bywa przypisywany także w przypadkach kiedy u dziecka nie występuje padaczka. Długotrwałe przyjmowanie leku powoduje, że pojawia się tolerancja i trzeba stopniowo zwiększać dawkę. Leku nie można też gwałtownie odstawiać. Lista skutków ubocznych związanych z długotrwałym przyjmowaniem leku jest długa.

Okazuje się, że w zależności od dawki działanie klonazepamu może się diametralnie różnić.

Grupa badaczy w skład której wchodził prof. Catterall postanowiła zbadać działanie klonazepamu w mysim modelu Zespołu Draveta. Idea początkowo wydaje się dziwna, bo przecież klonazepam jest już od dawna przypisywany osobom z ASD. Dlaczego więc warto się nad tym pochylać? Kluczem jest tutaj odpowiednia dawka leku, znacząca mniejsza niż dotychczas, powodująca inne rezultaty. Oddajmy głos autorom, którzy najpierw starali się dokładnie scharakteryzować deficyty u ich myszek.

Homozygous Scn1a−/− mice developed severe ataxia and died on postnatal day (P) 15, whereas Scn1a+/− mice had spontaneous seizures and sporadic deaths beginning after P21. Scn1a+/− mice develop multiple behavioral phenotypes, which are phenocopies of comorbidities in DS. During a 10-min open-field test, adult Scn1a+/− mice traveled significantly longer than WT (Fig. 1a) but spent less time in the center of the open field (Fig. 1b, Supplementary Fig. 1). In the elevated plus maze, Scn1a+/− mice entered open arms less frequently compared with WT (Fig. 1c), and spent less time in the open arms (Fig. 1d, Supplementary Fig. 2). Scn1a+/− mice also spent more time self-grooming than WT (Fig. 1e, Supplementary Fig. 3a) and displayed increased circling behavior (Fig. 1f, Supplementary Fig. 3b). These observations indicate that Scn1a+/− mice exhibit hyperactivity, increased anxiety, and increased stereotyped behaviors, which are phenocopies of autistic traits in DS. Scn1a+/− mice also showed decreased nest-building ability compared to WT (Supplementary Fig. 4), which could indicate deficits in social behavior.

A three-chamber experiment showed that Scn1a+/− mice displayed profound deficits in social interaction.

However, when we put a stranger mouse in the cage in one chamber, WT mice spent more time in the mouse-containing chamber than in the empty cage-containing chamber (Fig. 1g, Supplementary Fig. 5), and interacted more extensively with peer mice than with the empty cage (Supplementary Fig. 7b). In contrast, Scn1a+/− mice displayed no preference for the stranger mouse (Fig.1g, Supplementary Fig. 5, 7b). When a second stranger mouse was placed in the unoccupied side chamber to assess the discrimination between a novel and a familiar mouse, WT mice showed strong preference for the novel mouse, but Scn1a+/− mice did not (Fig. 1h, Supplementary Fig. 5, 7c), even though they have preference for novel objects (see below).

Scn1a+/− mice failed to improve their learning performance during four days of training (Fig. 2d, e), and displayed substantially reduced spatial memory during the probe trials at day 5 (Fig. 2f – i). These data, together with the results of the context-dependent fear-conditioning test (Fig. 2c), indicate that Scn1a+/− mice have severely impaired spatial learning and memory.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3448848/

Widać z powyższego, że badacze w ocenie stanu myszek wykorzystali testy, które pobieżnie przedstawiliśmy wcześniej. Poza zachowaniami ze spektrum autyzmu myszki uczyły się też gorzej i miały gorszą pamięć. Myszkom podano klonazepam w mikrodawce. Konkluzja badaczy poniżej.

Given that the autism-related phenotype and spatial-learning deficit in Scn1a+/− mice emerge from decreased NaV1.1 activity in GABAergic interneurons, we reasoned that they could be rescued by increasing the strength of GABAergic transmission. To test this idea, we treated Scn1a+/− and WT mice with the benzodiazepine clonazepam, a positive allosteric modulator of the GABAA receptor. Benzodiazepines do not open the GABAA receptor chloride channel in the absence of GABA, but instead boost GABA signaling only when presynaptically released GABA binds to the receptor.

Both in the open arena and in the three-chamber test, clonazepam treatment completely rescued impaired social behaviors of the Scn1a+/− mice, and this effect was reversed after the one-week clearing period (Fig. 5b, c; Supplementary Fig. 22, 23). In contrast, low-dose clonazepam had no effect on the social behavior of WT mice. Treatment with low-dose clonazepam 30 min before testing also rescued impaired context-dependent fear conditioning. Whereas WT mice were unaffected by clonazepam (Fig. 5d), Scn1a+/− mice displayed a complete reversal of the loss of their 30-min and 24-h contextual fear memory (Fig. 5e). These results indicate that a single low dose of clonazepam can reversibly rescue core autistic traits and cognitive deficit in Scn1a+/− mice.

These results support our hypothesis that behavioral rescue by treatment with clonazepam is associated with increased strength of inhibitory transmission.

High-dose benzodiazepine has been widely used to alleviate epileptic seizure and anxiety-like behaviors, but not for rescuing major autism-related behaviors because of its sedative effects. Remarkably, a single low-dose clonazepam injection completely rescued deficits in social interactions and fear-associated contextual memory without sedative or anxiolytic effects in Scn1a+/− mice. The reversible rescue of cognitive deficit and autism-related behaviors by clonazepam at the time of training implies that these comorbidities in DS mice are not caused by recurrent seizure-induced excitotoxicity, but instead are caused by Scn1a haploinsufficiency and the resulting reduction of GABAergic transmission. These results suggest that low-dose benzodiazepine treatment could be a potential pharmacological intervention for cognitive deficit and autistic symptoms in DS patients.

Our results suggest that low-dose benzodiazepine treatment may be effective in alleviating these autistic traits and cognitive impairment in DS and possibly in ASDs more broadly.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3448848/

Badacze sugerują, że nie tylko udało im się spowodować, że myszki przestały się zachowywać w autystyczny sposób, ale też stały się mądrzejsze. To szalenie ważne. Jak daleko jest ten eksperyment na myszkach od skutecznej terapii u ludzi? Być może niedaleko. Okazuje się, że istnieje już pewna grupa osób, które spróbowały podobnej interwencji. Niektóre z tych osób piszą o wyjątkowo pozytywnych efektach. Ponieważ klonazepam bywa często przypisywany w przypadku autyzmy (przynajmniej w Stanach) to jest spora szansa, że niektóre dzieci i tak miałyby przypisany ten lek. Jeśliby chcieć pójść droga prof. Catterall to dawka tego leku jest kilkanaście-kilkadziesiąt razy mniejsza niż to co wynika z ulotki. Zapewne lekarz zasugeruje, że w takiej dawce lek będzie zupełnie nieskuteczny. A może wręcz przeciwnie. Wydaje się, że takie małe dawki wyraźnie zmniejszają ryzyko pojawiania się efektów ubocznych, ale tutaj trzeba przeprowadzić badania. W praktyce okazuje się, że największym problem jest tutaj dawkowanie (bo np.: trzeba podać 1/20 tabletki) i to, że jest bardzo wąski zakres dawki w jakiej ten lek może być skuteczny. Tutaj jednak nie będę przepisywał tego co już zostało napisane lecz odsyłam bezpośrednio do blogu Petera (którego aktualny blog jest jedynie namiastką): [6], [7], [8].

Konkluzja

Zaburzenia w funkcjonowaniu kanałów sodowych powodują różnych obraz kliniczny. Obserwuje się zarówno encefalopatię połączoną z epilepsją jak i autyzm z niepełnosprawnością intelektualną. Ale te obserwowane fenotypy nie są do końca rozłączne. W przypadku autyzmy spowodowanego dysfunkcją kanałów sodowych też mamy czasem do czynienia z padaczką, a z drugiej strony osoby z encefalopatią wykazują wiele zachowań ze spektrum. Okazuje się, że intuicja bywa zawodna i brak przewodnictwa kanałów sodowych może paradoksalnie skutkować padaczką. To co jest najważniejsze w tym poście to to, że dysfunkcję kanałów sodowych można niwelować prowadząc interwencje, które nie są wycelowane w niepracujące właściwie kanały. Nierównowagę pomiędzy ekscytacją/inhibicją można próbować niwelować zarówno poprzez zmniejszanie ekscytacji jak i poprzez zwiększanie inhibicji. Nie jest to trywialne albowiem nadmierna inhibicja w jednym rejonie mózgu może powodować nadmierną ekscytację w innym rejonie (jak przypadku Zespołu Draveta). Wykorzystywane od dziesięcioleci leki mają znany profil bezpieczeństwa. Nawet jeśli ten profil bezpieczeństwa nie jest korzystny to jest on dobrze rozpoznany i wiadomo mniej więcej czego się spodziewać. Bywa tak, że różne dawki tego samego leku działają w inny sposób. Jeden z takich przykładów dotyczył klonazepamu i był przedmiotem badań na mysim modelu Zespołu Draveta. Chociaż rezultaty są obiecujące to prawdopodobnie potrzeba trochę czasu zanim zostanie podjęta próba na ludziach.

[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3448848/
[2] http://www.ice-epilepsy.org/the-sodium-channel-and-morbidities-associated-with-dravet-syndrome.html
[3] http://www.cco.caltech.edu/~phplab/images/whatwedo/EngSci31006.pdf
[4] https://pl.wikipedia.org/wiki/Klonazepam
[5] https://www.youtube.com/watch?v=VuWWtqxe9rM
[6] https://epiphanyasd.blogspot.com/2015/12/long-term-use-of-low-dose-clonazepam.html
[7] https://epiphanyasd.blogspot.com/2014/03/channelopathies-in-autism-treating.html
[8] https://epiphanyasd.blogspot.com/2015/08/low-dose-clonazepam-for-autism-sfari.html